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IGI 研究人员提高 CRISPR-Cas9 效率
如果您破坏 DNA 修复,CRISPR-Cas9 会更好地破坏基因
伯克利新闻 | 罗伯特·桑德斯 | 17 年 2016 月 XNUMX 日
CRISPR-Cas9 是淘汰赛的首选技术 基因 在人类中 细胞 线来发现基因的作用,但它使基因失效的效率可能会有很大差异。
加州大学伯克利分校的研究人员现在找到了一种方法,可以将 CRISPR-Cas9 在大多数类型的人类细胞中切割和禁用基因的效率提高五倍,从而可以更轻松地创建和研究敲除细胞系,并可能禁用 突变体 基因作为人类治疗的一种形式。
科学家们不断发现新基因或 蛋白质 它们编码,但要弄清楚它们在身体或疾病中的作用要困难得多。 发现这个角色的关键是禁用基因,看看当它被移除时会发生什么。
CRISPR-Cas9 切割 的DNA:CRISPR-Cas9 复合物(紫色)反复切割目标 DNA 片段,直到细胞修复 酶 在修补切口时出错,有效地禁用了基因。 加州大学伯克利分校的科学家通过干扰 DNA 修复过程获得了更好的切割成功,从而增加了出现拙劣补丁的可能性。 该图显示了 指导RNA (紫色)与 补充 DNA(蓝色)并对齐Cas9蛋白以精确切割两者 股 DNA(白星)。
虽然 CRISPR-Cas9 可以加速制造敲除细胞系的过程,但研究人员有时必须制造和筛选基因剪刀的许多变体,以找到一种效果良好的变体。 加州大学伯克利分校的研究人员发现,通过简单的调整,这个过程的效率可以提高很多倍。
关键是将与 CRISPR-Cas9 蛋白一起引入细胞的短 DNA 片段与人类的任何 DNA 序列都不匹配 基因组. 被称为寡核苷酸的短 DNA 片段似乎会干扰细胞中的 DNA 修复机制,从而将即使是平庸的 CRISPR-Cas9 的编辑性能提高 2 到 5 倍。
“事实证明,如果你做一些非常简单的事情——只需向细胞提供廉价的合成寡核苷酸,这些寡核苷酸在人类基因组的任何地方都没有同源性——编辑率会增加五倍,”首席研究员、科学主任雅各布·科恩说。加州大学伯克利分校的创新 基因组学 倡议和分子和细胞生物学助理兼职教授。 该技术提高了所有 CRISPR-Cas9 的效率,即使是那些最初根本无法工作的。
凭借更高的效率,研究人员将在创建他们想要的基因敲除方面取得更大成功,然后使用这些基因敲除细胞系来探索一个基因或一组基因的功能。 因为大多数长寿细胞系来源于 癌症 细胞——包括非常流行的 HeLa 细胞系——这些细胞系通常每个基因的拷贝数通常多于正常的两个拷贝。 这样就很难一次击倒所有副本,而更高的效率大大增加了成功的机会。
在敲除基因以纠正人类的遗传性突变时,高效率也是必不可少的。 医生们推测敲除使人容易感染艾滋病等传染病或易患自身免疫性疾病、炎症或神经退行性疾病的基因。 Corn 及其同事描述的方法是否可以用于治疗环境还有待观察,但它对于研究目的非常有效。
结果将于 17 月 XNUMX 日在在线期刊《自然通讯》上报告。
DNA 修复是 CRISPR-Cas9 成功的关键
CRISPR-Cas9 分子由蛋白质剪刀、Cas9 蛋白质和一个地址组成,该地址告诉 Cas9 在哪里结合 DNA 并进行切割。 该技术依赖于这样一个事实:当你切割 DNA 时,细胞的修复机制并不总是正确地重建 DNA 链,而是在序列中出错,使基因失效并破坏其活性。
Tha地址,称为指南 RNA, 是一串 20 个核糖核酸分子,与目标基因的 DNA 序列互补。 这种引导 RNA 像一条魔术贴一样与 DNA 结合,设置 Cas9 来切割双链 DNA。
为什么一些引导 RNA 运行良好,设置 Cas9 以在近 100% 的时间内切割和禁用基因,而其他引导RNA 结合但很少或永远不会敲除该基因,自从该技术由加州大学伯克利分校的詹妮弗·杜德娜 (Jennifer Doudna) 发明以来一直是一个难题2012 年 Umea 大学的 Emmanuelle Charpentier 和 Emmanuelle Charpentier。Corn 说,切割效率因细胞类型和特定细胞系而异。
Corn 怀疑 Cas9 偶尔的低切割效率可能与 DNA 的修复方式有关,因为 DNA 修复机制——修复 DNA 中可能导致致命突变的任何断裂或缺失的基本管家酶——因细胞而异。 他推断随机 DNA 链——它们与任何实际的人类 DNA 都不相似(即非同源)——可能会混淆修复过程并提高敲除成功率。
“它给细胞一点刺激,以防止发生正常的修复,”他说。
他描绘了 CRISPR-Cas9 基因编辑 作为切割和 DNA 修复之间的竞争:一旦 Cas9 切割,细胞就会准确地替换 Cas9 再次切割的切割 DNA,在无休止的切割和修复循环中,直到修复酶出错,基因最终失去功能。 他说,也许寡核苷酸会降低修复过程的保真度,或者使细胞转向更容易出错的修复,从而使 Cas9 更容易破坏基因。
他说,下一个前沿是试图利用 DNA 修复的特性来改善序列插入,以便用正常基因替换有缺陷的基因并可能治愈遗传疾病。
该研究由博士后研究员 Chris Richardson 和 Nicolas Bray 以及前研究助理 Jordan Ray 共同撰写,由李嘉诚基金会资助。
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非同源 DNA 通过改变 DNA 修复结果来提高基因破坏效率
自然通讯 | CD Richardson、GJ Ray、NL Bray 和 JE Corn | 17 年 2016 月 XNUMX 日