迄今为止,我的大部分博客文章都讨论了围绕科学业务的大局。 但今天是获取真实数据的时候了。 今天出入 自然·生物技术“ 是我们关于新见解的论文 Cas9 机制及其在人类中增强精确序列替换的用途 细胞.
TL博士 Cas9 “拍打”了部分 的DNA 目标,你可以利用它来增加频率 HDR.
我们从一个非常简单的问题开始:Cas9 切割和外观之间会发生什么? 基因组 编辑? 这可以通过各种有趣的方式来回答,包括阐明 DNA 修复机制。 我们选择更简单,弄清楚 Cas9 和 核糖核酸 与 DNA 靶标相互作用和分离。
当我们发现催化失活时,我们的第一个惊喜出现了 dCas9 需要一个 非常 与 DNA 分离的时间很长。 就像,六个小时或更长时间! 比人们预期的要长得多 酶 这基本上是一种可重定向的限制性内切酶。 当我们发现活跃和不活跃的 Cas9 在这方面表现相同时,我们的第二个惊喜出现了——即使在 Cas9 切割 DNA 目标后,它仍会保持绑定状态 XNUMX 小时。 这段时间对我们来说意义重大,因为它具有神秘感。 当一个使 双链断裂 in 真核 使用辐射的细胞, 他们修复得非常快. 但是当 Cas9 使双倍 缕 打破它需要(等待它) 大约需要六个小时才能修复它们。
使用标记的 DNA 分子,我们发现 Cas9 全局固定在切割双链体的两侧。 也就是说,半双工都不会飘走。 但是我们接下来想知道切割后复合体的更细粒度的性质。 就在那时,我们得到了第三个惊喜。 事实证明,当 Cas9 抓住切割双链体的四条链时(想一想那一条),它只能紧紧抓住其中的三条。 对面的 DNA 链 PAM 非目标链(未受 sgRNA 结合的链)上的 sgRNA 在微风中飘动。 以至于 细胞/组织 我们可以退火一个 补充 一段ssDNA。 dCas9 做同样的事情,但由于它不切割目标 DNA,现在在 sgRNA 对面形成了一个完整的 DNA 气泡。 如果这个描述让你目瞪口呆,这是我的意思的图片(灰色是 Cas9,蓝色是 sgRNA,黄色是 PAM,红色是活性位点,白色 x 是 Cas9 紧紧抓住目标)。
将互补单链寡核苷酸退火到 DNA 瓣的能力让我们想到了 Nancy Maizels 实验室的最新工作,它描述了一个 缺口 修复结构,其中单股修复模板退火到皮瓣的一侧。 谈到人类细胞,我们询问是否可以使用能够与 Cas9 皮瓣退火的寡核苷酸供体进行序列替换。 我们非常惊喜。 Cas9 皮瓣大约为 20-30 核苷酸事实上,我们发现编辑与皮瓣互补约 30 个核苷酸的供体在所有供体中始终发挥最佳效果。 绝对频率各不相同,但在一个基因座上,我们可重复地观察到高达 60% 的序列替换。 正如人们预期的那样,使互补区域更短会降低效率,而使其更长也会导致效率降低,我们认为因为它需要侵入瓣外完整的双链体。
最后,我们决定尝试一个疯狂的实验。 我们想知道由无催化活性的 dCas9 形成的气泡是否可用于使细胞中的单链供体退火,以及是否可以诱使该细胞使用它进行修复。 通过将三个 dCas9 靶向一个精确间隔的区域,该区域与单链供体的长度相匹配,并且都位于同一条 DNA 链上,我们确实观察到序列替换率略低于 1%。 这绝不是一个很大的数字,但它是在没有任何通常伴随 Cas9 切割的容易出错的修复的情况下实现的。 我们仍然不知道 dCas9 编辑背后的机制,但它对于解决序列替换具有某种适应性优势但容易出错的基因修复的遗传疾病可能非常有用。 基因 将是灾难性的(例如,如果破坏基因比离开基因更糟糕) 突变 单独)。
我很好奇 Cas9 意想不到的飞扬机制,想知道它是否在 Cas9 在 CRISPR 抗病毒 生物学。 我对细胞使用单链供体的机制也越来越感兴趣。 埃里克·亨德里克森 和 南希·梅泽斯 在这方面有一些很棒的故事,我的实验室有一些数据似乎可以说明一些问题。 从更实际的角度来看,Cas9 目前非常擅长破坏基因,但其精确引入突变的能力却落后了。 我很乐观地认为,我们发现的这些设计序列替换实验的简单方法不依赖于细胞的化学操作,可用于解决各种遗传疾病。 很快就会有更多内容。
这份手稿由一个出色的团队撰写:博士后 Chris Richardson、技术人员 Jordan Ray(即将进入研究生院)、前实验室经理 Gemma Curie 和博士后 Mark DeWitt。 恭喜他们!