向导RNA 知识分散在多篇论文、人物和地点，我经常被问到制作指南的“最佳”方式 RNA Cas9. 以下是我所理解的最新技术，截至今天（8 年 11 月 14 日），分为几个步骤。 以下步骤假设您要使用 化脓性链球菌 Cas9 剪一个 基因 引入插入/删除（“插入”) 使用双键进行淘汰赛（最简单的用例）缕 切割（野生型 Cas9）。 如果您想（例如）使用，该过程可能会有所不同 克里斯普里 抑制 转录. 我已经使用 * 来标记对于其他应用或如果您使用不太常见的部分（例如来自其他物种的 Cas9、不同的引导 RNA 启动子等）至少会有所改变的步骤。 在开始之前
- 确定您要执行的定位类型。 在这里，我们正在考虑通过引入插入缺失进行双链切割以进行淘汰赛。
- 决定您将使用哪个 Cas9。 在这里，我们假设您正在使用 化脓性链球菌 （又名“间谍”）。 这个选择会影响 原始间隔区相邻基序 （“PAM”）你会寻找。*
- 获取 基因组 您想要定位的序列 NCBI基因 或其他地方（例如，如果您的目标是基因间区域）。*
- 对于敲除，您通常希望在尽可能靠近编码区 5' 端的位置引入插入缺失。 这将最有可能创建一个 蛋白质- 破坏移码。*
寻找指南
- 使用众多服务器之一在您想要切割的区域中查找引导 RNA。 例如， CRISPR-麻省理工学院, 电子脆片或 劈斩. 您选择哪种工具主要是个人喜好，每个工具都有自己的评分指南 RNA 的模型。
- 每个目标站点将是 ~23 基础 以“结尾
GG”（引导结合 Crick 链）或 ~23 个碱基以“CC”（引导绑定沃森链）。 原始间隔区相邻基序（“PAM”）是指最后或前三个碱基，存在于 的DNA 你的目标，但应该 不能 用于指导 RNA。 因此，向导 RNA 本身将是约 20 个碱基并且缺少 PAM。 SpyCas9 也可以使用“AG“ （沃森 ”CT“) 作为 PAM，但效率不高。 - 指南的确切长度似乎并不重要； 任何 17-27 个碱基（记住，指南不包括 PAM）似乎都可以（有一些限定词）。
选择指南 现在您有一个（可能很长）潜在指南的列表。 每一项都有相关的分数。 你如何选择使用哪一种？ 这是要考虑的因素的半有序列表，从最重要到最不重要。 考虑这些定性的，而不是定量的分数。
- 对于敲除，引导 RNA 结合哪条链并不重要，但是 克里斯普里 指南应该是 补充 到非编码链。 *
- 指南应该与您想要在最接近 PAM 的 8-12 个碱基中定位的区域完美互补。
- 永远不要选择具有任何重要意义的指南 不中 基因组编码中的位点（与 PAM 最接近的 8-12 个碱基的完美匹配）。
- 切勿使用连续 >=3 个 U 的指南，因为这些序列充当 Pol III 终止子。 如果您使用的是 Pol II 载体而不是常见的 U6 启动子载体，这显然不适用。*
- 首选具有 PAM 的指南
NGG而不是NAG.* - 避免具有重要二级结构的序列（ 维也纳网络服务器 是检查这个的好地方）。 您还应该避免破坏 3' 恒定区二级结构的引导线（最常见的恒定区序列是
"GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU"). - GC含量 应该在 ~ 30-80% 之间，越高越好（但不要太高！）。
- 避免额外
G在 PAM 之后。 例如，“|AGG|CCAT”可能没问题（其中“AGG”是 PAM）。 但 ”|AGG|GCAT”可能不是一个好主意，并且“|AGG|GGGG”是一个明确的禁忌。* - 一些团体已经表明
U不喜欢出现在 -1、-2 和 -4 位置（从恒定区的第一个碱基开始倒数）。其他小组还没有看到这一点。你的旅费可能会改变。 - DNAse 超敏感区域中的首选指南（如 ENCODE 在 UCSC 基因组浏览器）。 这不是必需品，但可能不会受到伤害。
- 这是 最近被显示 切割位点的微同源性可以大大增加获得框架外插入缺失的机会。 这不会影响切割本身，但可以帮助您获得淘汰赛。
最终指南的构建
- 取上面选择的引导序列并附加常量序列“
GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU”到 3' 端。 - 如果您的指南不是以 5' 开头
G，加一个。 这提高了 U6 启动子的转录效率，并且不需要与您的目标区域同源。* - 添加适合的克隆位点 表达 您选择的向量。 例如，如果使用张的实验室 PX330 向量，附加“
CACC” 到 Watson 链的 5' 末端和“AAAC”到 Crick 链的 5' 端。* - 订购寡核苷酸、退火和结扎。
上面的内容可能看起来很多，但实际上并没有那么糟糕。 您将很快了解什么是好的指南和差的指南。 由于测试多个指南非常容易，因此我始终建议您为每个想要制作的淘汰赛制作至少两个指南。 这样，如果一个人是哑巴，你就不会措手不及。 显然，上面的列表中有很多 *s，表示如果您的应用程序或部件与 间谍Cas9 制作一个 双链断裂 为了淘汰赛。 工具箱一直在扩展，所以选择比比皆是！ 但希望以上内容提供了如何开始的总体思路。 你有另一个巧妙的技巧要分享吗？ 我错过了什么重要的事情吗？ 想要阐述制作 CRISPRi 指南（一个完整的其他蜡球）的最佳方法吗？ 欢迎发表评论！
