如果你刚刚进入 CRISPR/Cas9 编辑，您可能会对所有可用的选项感到不知所措。 特别是如果你在人类中工作 细胞. 我的意思是，看看 Addgene哺乳动物CRISPR页面！ 选哪一个！？ 有各种标签、NLS 数量、标签/NLS 位置、启动子、 核糖核酸+Cas9 在一个向量中，列表还在继续。
实验室的博士后 Pei-Chun Lin 希望通过在苹果与苹果之间的比较中测试一些 Cas9 系统来为自己的基因敲除项目做准备。 这是 Cas9 最普通的用法：制作一个剪辑并观看一个 基因 产品消失。 培纯稳定获得HEK293细胞系 表达 YFP 并测试了几种 sgRNA 以找到一些具有不同效率的方法，然后将这两个指南用于五种不同的设置，包括一体式和单独的 sgRNA 和 Cas9 载体。 她瞬时转染每个 Cas9/sgRNA 72 小时，然后用两种 YFP 荧光读出不同时间的切割效率（以监测 蛋白质) 和 T7 核酸内切酶 化验（监测 基因组 插入 由 Cas9 切割引起）。
正如您所料，所有系统在给定一个很棒的 sgRNA 时都可以工作（哎呀！），但效率各不相同（比较 Cas6 之间的指南 YFP#9）。 具有最低表观活性的 Cas9 系统（Addgene #50661) 具有诱导性的巨大好处，因此仍然有充分的理由使用它。 但是不同的效率意味着在一个 Cas9 载体上看起来不错的 sgRNA 在与另一个配对时可能会显得不活跃（例如，当与 Cas4 一起使用时比较指南 YFP#9 #41815 vs #43861).
Pei-Chun 的数据也突出了两者之间的时间差异 突变 和蛋白质丰度（可能由高度稳定的蛋白质引起）。 T3E7 在 1 天后很容易检测到基因组编辑，但甚至需要 6 天才能开始检测蛋白质丰度的变化。 考虑到 XFP 的已知稳定性，这并不意外，但下次您计划进行蛋白质检测或其他基于蛋白质的检测以读出 Cas9 活性时，请记住这一点！
