Las formas de vida más pequeñas tienen el sistema CRISPR de trabajo más pequeño

Noticias de Berkeley | Robert Sanders | 18 de octubre de 2018

Según lo informado por los científicos de IGI hoy en Ciencias:, un antiguo grupo de microbios que contiene algunas de las formas de vida más pequeñas de la Tierra también tiene la más pequeña CRISPR efector descubierto hasta la fecha.

El peewee proteína maquinaria, apodada Cas14, está relacionado con sólo un tercio del tamaño de la Cas9 proteína, el fin comercial del revolucionario gen-herramienta de edición CRISPR-Cas9. Mientras que Cas9 estaba aislado de bacterias fotosintéticas, Cas14 se encontró en el genoma, de un grupo de Archaea - un pariente primitivo de las bacterias - que contiene algunos de los más pequeños células y los genomas más pequeños conocidos.

Cas9 y otros Proteínas Cas Las proteínas son parte de un sistema de defensa desarrollado por microbios para protegerse de virus. Todos están dirigidos enzimas CRISPR-Cas que buscan y se unen de manera muy selectiva a un letra singular or moléculas de ARN secuencia, en microbios, aquellos que coinciden con las secuencias almacenadas en sus bancos de memoria CRISPR después de infecciones virales anteriores, y luego corta el ADN o ARN para desactivar al nuevo invasor.

Al igual que Cas9, Cas14 tiene potencial como herramienta biotecnológica. Debido a su pequeño tamaño, Cas14 podría ser útil para editar genes. Pero con su monocatenario Actividad de corte de ADN, es más probable que mejore los sistemas de diagnóstico CRISPR rápidos que se encuentran actualmente en desarrollo para enfermedades infecciosas, genéticas mutaciones y células cancerosas.

“Para los diagnósticos moleculares, se debe poder apuntar al ADN bicatenario, al ADN monocatenario y al ARN”, dijo Lucas Harrington, estudiante de posgrado de UC Berkeley y primer autor de un artículo que informa sobre el descubrimiento. "Cas12 es realmente bueno en el reconocimiento de ADN de doble cadena, Cas13 es realmente bueno en el reconocimiento de ARN monocatenario y ahora Cas14 completa el conjunto: es realmente bueno en el reconocimiento de ADN monocatenario ".

Cas14 es similar a Cas12 y Cas13 en que, después de unirse a su secuencia de ADN objetivo, comienza a cortar indiscriminadamente todo el ADN monocatenario dentro de una célula. Cas9, por el contrario, se une y corta solo el ADN objetivo.

El corte sin sentido del ADN es una posible desventaja en la terapia, pero una gran ventaja en el diagnóstico. La proteína Cas14 se puede emparejar con un marcador fluorescente unido a un fragmento de ADN monocatenario. Cuando Cas14 se une a su secuencia de ADN objetivo, un gen del cáncer o un gen en bacterias infecciosas, y comienza a cortar el ADN, también cortará el ADN vinculado con el marcador, generando una señal fluorescente.

Obtenga más información sobre cómo los científicos pueden utilizar las enzimas CRISPR para diagnosticar infecciones y enfermedades.

"Cas14 se dirige al ADN monocatenario de una manera mucho más específica que Cas12", agregó la colega de Harrington, Janice Chen, quien recientemente recibió su Ph.D. de UC Berkeley. “Ese fue un hallazgo realmente inesperado. Debido a que es tan pequeño, apenas pensamos que podría funcionar, pero en realidad es súper específico, lo que lo convierte en una adición realmente poderosa a la caja de herramientas de diagnóstico ".

Harrington, Chen y sus colegas, incluida la inventora de CRISPR-Cas9 Jennifer Doudna, profesora de biología molecular y celular y de química de UC Berkeley, han adaptado Cas14 para que funcione con su sistema de diagnóstico, llamado DETECTR, que ahora usa Cas12 y Cas13 para detectar rápidamente la presencia de organismos infecciosos y mutaciones genéticas. Harrington, Doudna y Chen son cofundadores de una empresa, Mammoth Biosciences, que comercializa DETECTR.

El descubrimiento será informado en línea 18 de octubre antes de la publicación impresa en la revista Ciencias:. Doudna es investigadora del Instituto Médico Howard Hughes y codirectora de Innovative Genómica Instituto. Banfield es el líder de microbiología de IGI.

Minería de metagenomas

La proteína Cas14 fue encontrada por los coautores Harrington y David Burstein, ahora profesor en la Universidad de Tel Aviv en Israel, mientras buscaban variantes de Cas en una base de datos de genomas microbianos creada durante los últimos 15 años por sus colegas de UC Berkeley: una equipo dirigido por Jill Banfield, profesora de ciencias terrestres y planetarias y de ciencias ambientales, políticas y gestión. Los genomas, que se cuentan por decenas de miles, fueron obtenidos por metagenómica secuenciación de todo el ADN en muestras de una variedad de entornos exóticos. Cas14 se encontró en el genoma de Archaea secuenciado a partir de muestras de agua subterránea obtenidas de un sitio de limpieza tóxica en Rifle, Colorado.

Hace dos años, Harrington y Burstein descubrieron otras pequeñas proteínas Cas, CasX y CasY, mientras exploraban la base de datos de metagenómica.

Cas14 es la mitad del tamaño, entre 400 y 700 aminoácidos de longitud - de CasX y más pequeño que todos los demás sistemas Cas conocidos, que varían en longitud de 950 a 1,400 aminoácidos.

“Por casualidad, encontramos estas proteínas muy pequeñas, que otras personas simplemente tiran porque no se parecen a los sistemas CRISPR conocidos anteriormente. Son demasiado pequeños ”, dijo Harrington. “Decidimos, qué diablos, vamos a intentarlo. Lo probamos y nos sorprendió descubrir que se trataba de sistemas funcionales reales ".

Encontrar el gen de Cas14 en la base de datos fue solo el comienzo. La mayoría de las proteínas Cas hasta la fecha se han encontrado en bacterias y, por lo tanto, funcionan bien en la bacteria de laboratorio estándar, E. coli. Pero Cas14 es de Archaea, y un grupo de los más pequeños de Archaea, llamado DPANN. Todas las proteínas Cas incorporan trozos de ARN para la focalización y la unión, pero Cas14 no funcionará con los ARN CRISPR-Cas9, por lo que el equipo también tuvo que extraer de la base de datos los dos ARN que deben estar presentes para que Cas14 funcione.

Además, DPANN Archaea no se puede cultivar en el laboratorio, parecen ser parásitos o de alguna manera dependientes de otras Archaea más grandes, por lo que los investigadores tuvieron que crear el entorno adecuado en un tubo de ensayo.

De acuerdo con sus orígenes en un microbio más primitivo, el Cas14 adelgazado parece ser una versión más primitiva de las proteínas Cas9 y Cas12 más grandes y complejas, dijo Harrington, insinuando que las moléculas han evolucionado durante eones para ser más especializadas. Los investigadores esperan aprender de estas proteínas Cas primitivas, que son los componentes esenciales de la enzima Cas, para poder diseñar los cortadores de genes más compactos y elegantes que puedan.

Harrington señaló que la minería metagenómica reveló varias versiones de Cas14 que pueden resultar útiles herramientas biotecnológicas. "Una cosa asombrosa ... es la diversidad de estos sistemas", dijo. “Hemos descrito más de 40 nuevos sistemas CRISPR-Cas14 y ocho subtipos diferentes. Esto abre las compuertas para la investigación de estos nuevos sistemas CRISPR ”.

Los coautores con Harrington, Burstein, Chen, Doudna y Banfield son Enbo Ma, Isaac Witte, Joshua Cofsky de UC Berkeley y David Paez-Espino y Nikos Kyrpides del Instituto Conjunto del Genoma del Departamento de Energía en Walnut Creek, California.

El trabajo fue financiado por la National Science Foundation, el Departamento de Energía de EE. UU., IGI y el Instituto Allen.