自然界中的 CRISPR

这个单词 噬菌体 是短期的 噬菌体，类型 病毒 会感染细菌。

在海洋深处，在我们自己的肠道中，以及介于两者之间的任何地方，噬菌体正在感染各种细菌。 尽管它们肉眼看不见，但噬菌体实际上是地球上最丰富的类生命形式！ 我们说“栩栩如生”是因为 病毒 不符合 标准 被认为是活的有机体。

和人一样 细胞 使用 的DNA 作为对其功能的说明，噬菌体携带 DNA（或 RNA) 基因组 作为他们组装和传播的蓝图。 然而，噬菌体不能自行繁殖。 他们必须在感染过程中从细菌中获取资源，并利用这些资源来生产更多的噬菌体。 这就是为什么它们只是“栩栩如生”。

借助显微镜，科学家可以观察噬菌体感染过程。 噬菌体看起来像微小的月球着陆器（但它们可以有其他 有趣的形状 也！）。 它们奇怪的结构通常包括类似于头部、颈部和腿部的部件。 当噬菌体落在细菌上时，它会用它的腿或 尾纤维. 然后，噬菌体的 DNA 从其储存空间 头，沿着一个叫做 尾巴，并进入细菌细胞。

噬菌体将其 DNA 注入细菌后，细菌自身的 蛋白质 机器复制噬菌体基因组。 然后细菌按照噬菌体 DNA 中的指令生成更多的头、尾、尾纤维和其他噬菌体片段。 这些“身体部位”组装形成新的噬菌体。

一旦噬菌体达到临界质量，它们就会从或 裂解 细菌并逃逸到环境中。 这类似于气球弹出。

每次感染一个新的细菌细胞，就会产生一批新的噬菌体。 感染可以因此呈指数级传播，迅速接管细菌群落。 这被称为 溶血的 周期。 相比之下，所谓的 溶原性 噬菌体将它们的 DNA 隐藏在受感染细菌的基因组中。 它们处于等待状态，只有在以后条件合适的时候才会产生更多的噬菌体。

在自然界中，噬菌体的数量比细菌多十比一。 如果噬菌体如此擅长杀死细菌，地球上怎么还有细菌？ 细菌已经进化出一系列抵御噬菌体的技巧。 他们的每个防御系统的工作方式都略有不同，我们在这里只展示一些一般类型。 有很多，我们仍在学习它们是如何工作的！

也许最明显的防御措施是首先防止噬菌体落在细菌细胞上。 细菌细胞膜上覆盖着不同的 受体、蛋白质或蛋白质组，它们从外部环境中识别分子并将信号传递给细菌。 噬菌体利用细菌受体来达到自己的目的。 它们通过在称为吸附的过程中粘附在受体上而附着在细菌宿主上。 一些细菌通过改变受体结构或引入物理屏障来防止噬菌体附着，从而阻止噬菌体与其表面结合。

或者，一些细菌会阻止噬菌体 DNA 进入 细胞质 （细胞内部）。 为了将它们的 DNA 注入细菌细胞，噬菌体必须穿透细胞膜。 通过将新蛋白质添加到该膜中，细菌可以堵塞噬菌体入口并阻止 DNA 注射。

当噬菌体 DNA 进入细胞质时，一些细菌可以阻止基因组被复制，而另一些细菌会阻止复制的噬菌体基因组被加载到细胞质中 衣壳 并冲出细胞。

许多细菌部署 限制性修饰 (RM) 系统破坏注入细胞的噬菌体 DNA。 这些防御系统由称为剪刀状的蛋白质组成 限制 酶. 这些酶将噬菌体 DNA 分开，从而破坏了制造更多噬菌体的指令。 

为了防止自身的 DNA 被限制性内切酶破坏，细菌会添加保护性化学物质，称为 甲基 到他们的基因组。 限制性内切酶已经进化到忽略甲基化 DNA 并且不会将其切割。 因此，甲基化使细菌基因组保持安全。

如果噬菌体设法绕过所有这些保护措施，那么细菌的最后一道防线就是细胞自杀。 这种“利他”行为会杀死单个细菌，但会阻止产生更多可能继续感染邻近细胞的噬菌体拷贝。 该过程的一个常见版本称为流产感染。

考虑到上述所有防御系统 先天 防御。 这意味着它们通常进化缓慢，在感染过程中迅速起作用，并且通常防御噬菌体而不是任何一种特定的噬菌体。 几乎每一种细菌都有某种形式的先天防御。

大约一半的细菌也有 自适应 免疫机制称为 CRISPR-CAS号 系统，它防御特定类型的噬菌体。 该系统可以适应并迅速产生针对新噬菌体挑战者的免疫力。 还有其他类型的适应性免疫系统。 我们专注于 CRISPR-Cas 免疫，我们将在下一节中更详细地描述。

细菌使用多种防御手段来阻止噬菌体的攻击，包括一种独特的适应性免疫，称为 CRISPR-Cas系统 （或简称CRISPR系统）。 这些系统存在于大约一半的细菌物种和几乎所有的古细菌中，尽管它们在 微生物 我们不能孤立地培养。 简而言之，CRISPR 系统的工作原理是捕获入侵噬菌体 DNA 的小片段，将它们储存在宿主细胞的基因组中，并使用这些分子记忆来寻找和破坏匹配的噬菌体。

那么 CRISPR 的不同寻常的名字是从哪里来的呢？ 首字母缩略词 CRISPR (c有光泽 r定期地 i间隔 s园艺 p阿灵 repeats) 来自细菌基因组中的一段 DNA。 这种 DNA 被称为 CRISPR 阵列或重复间隔阵列，它有两个组成部分——重复和间隔。 

• 重复 — 这些都是具有相同序列的 DNA 片段。 他们一般在30左右 碱基对 长。 重复在 CRISPR 首字母缩写词中称为“回文”，因为它们通常包含一段 基础 其次是 补充 相同序列的碱基，顺序相反。 这可能很难想象，所以看着 插图 和 可视化 可以帮忙。 术语来自 语言中的回文：可以以相同方式阅读的单词或短语 前进后退，就像“赛车”。

  这种内部互补性很重要，因为这意味着大多数 CRISPR 重复折叠成一个称为茎环或发夹结构的结构。 转录 成 RNA。

  注意： Cas9 系统确实 不能 有回文重复。 而不是单 核糖核酸 Cas9 的 crRNA 在内部进行碱基对，与第二段 RNA 进行碱基对，称为 追踪RNA （显示在第一个插图中 下一章). 

• 垫片 - 这些位于重复之间。 它们是噬菌体 DNA 的小片段，每一个都不同。 这些就是上面描述的“分子记忆”。 间隔物是先前噬菌体感染的残余物，它们通过几代细菌传下来。 这意味着单个细胞不必为了对噬菌体免疫而自身被感染。

在大多数情况下，您会发现一组与 CRISPR 相关的，或 CAS, 基因 就在重复间隔阵列旁边。 这些基因编码 Cas蛋白，它执行免疫所需的所有活动。 除了抵御噬菌体，CRISPR 系统还可以阻止其他侵入性 核酸， 喜欢 质粒. 

有多种不同的 CRISPR 系统，但它们都通过以下三个基本步骤来保护细菌：间隔物获取、CRISPR RNA 生物发生和干扰。 让我们更详细地了解每个步骤。

CRISPR系统通过记住噬菌体感染来工作，因此CRISPR免疫的第一步是产生记忆。 当噬菌体感染配备 CRISPR-Cas 系统的细菌时，可以将新的间隔序列添加到 CRISPR 阵列中。 这通过一个称为 获得 or 适应.

在这个过程中，两种 Cas 蛋白 Cas1 和 Cas2 共同作用以捕获注入的噬菌体 DNA 片段。 Cas1-Cas2 复合物充当标尺，与辅助蛋白质一起测量和切割出精确大小的 DNA 片段。 该复合物保留噬菌体 DNA，并将其插入 CRISPR 阵列的一端作为新的间隔区。 该系统在此过程中加入了一个新的重复，因此所有垫片的两侧总是有重复。 细菌由此存储噬菌体的记忆。

这一步类似于 接种疫苗 ——你可以想象重复间隔阵列就像一张疫苗接种卡，上面显示了细菌可以免疫的所有噬菌体。

CRISPR系统将这些噬菌体感染记忆存储在其DNA中，但不使用DNA直接识别随后的噬菌体感染。 相反，他们将 DNA 记忆转化为类似的分子，称为 RNA. RNA 在化学上与 DNA 不同，通常作为 单链. 细菌会制造许多噬菌体记忆的 RNA 拷贝，并使用它们来寻找新入侵的噬菌体。 制作这些 RNA “工作副本”很有用，因为它们可以在不破坏原始永久记忆的情况下分解和回收。

这个过程的生物学术语是 CRISPR RNA生物发生. 它涉及将整个 CRISPR 重复序列和间隔序列转录成一段长的 RNA，称为 前体 CRISPR RNA (pre-crRNA). 通常情况下，Cas 蛋白然后切割或 '劈开' 长的 RNA 变成短的、单独的片段。 这些包含一个间隔和部分重复。 噬菌体记忆的最终、完全修剪的 RNA 拷贝被称为 CRISPR RNA (crRNA). 接下来，Cas 蛋白将使用每个 crRNA 来寻找并积极识别匹配的噬菌体 DNA。

CRISPR 免疫的最后一步会破坏入侵的噬菌体 DNA。 这个过程称为 干扰，因为它涉及到 CRISPR 系统“干扰”或停止噬菌体的生命周期。 干扰始于单个 Cas 蛋白或一组 Cas 蛋白抓住或 捆绑 一个crRNA。 Cas 蛋白和 crRNA 一起形成了所谓的 搜索复合体, 效应复合物，或者我们在这里称之为 - 监视综合体. （当蛋白质、RNA 或其他成分的多个分子相互粘附并一起工作时，它们被称为 复杂.)

当噬菌体将其 DNA 注入细菌细胞时，监视复合体会在噬菌体的基因组中寻找与其 crRNA 中的间隔区匹配的序列。 这个目标序列称为 原型间隔物. 因为 crRNA 是原始噬菌体 DNA 的副本，所以它是 补充 与同一物种的另一个噬菌体注入的一条 DNA 链形成碱基对。 RNA 和 DNA 之间的碱基对看起来与正常双螺旋中每条 DNA 链之间的碱基对非常相似。

监控复合体解开噬菌体 DNA 并检查 crRNA 是否可以与一条链进行碱基配对。 如果整个间隔区可以碱基配对，这意味着监控复合体已经找到了它一直在寻找的目标，因此它会切割噬菌体 DNA 来破坏它。 如果监视复合体搜索了细胞中的所有 DNA，但没有找到匹配项，则不会进行任何切割。

CRISPR 监视复合物通过切割 DNA 来破坏它。 他们根据 CRISPR-Cas 系统进行不同类型的切割。 一些系统在每条链中进行一次中断。 有些会同时切割目标和任何附近的 RNA 或 DNA。 还有一些人像割草机一样一点一点地咀嚼目标。 在噬菌体 DNA 至少被切割一次后，细胞内的其他蛋白质会帮助分解其余的蛋白质。

由于噬菌体的复制指令被破坏，感染就结束了。 由于其 CRISPR 防御系统，这种细菌得以存活。 总之，CRISPR系统通过记住旧的噬菌体感染并在再次攻击时使用该记忆识别并阻止相同类型的噬菌体来保护细胞。

🎥 | 你可以回顾整个 CRISPR免疫过程 在下面的视频中。 这部动画，由 IGI 创作 珍妮特·岩佐，以包含 Cas9 的 CRISPR 系统为例，因此它比我们在此处提供的概述更具体一些，但您将看到所有三个关键步骤：间隔物获取、crRNA 生物发生和干扰。

最后，关于“间隔”术语可能令人困惑的变体的注释：

• 前置间隔 - 采集机器选择一段称为前间隔区的噬菌体 DNA 并将其整合到细菌 CRISPR 阵列中。
• 间隔 - 一旦噬菌体 DNA 被整合到 CRISPR 阵列中，它就被称为间隔区。 在从阵列中转录出 crRNA 后，该 RNA 的噬菌体衍生序列也称为间隔区。
• 原型间隔器 - 噬菌体基因组中与 crRNA 互补并被监视复合物切割的 DNA 片段称为 protospacer。 这 PAM 是一个与原型间隔子相邻的基序，意思是紧邻监视复合体目标的短序列。

在 CRISPR 防御过程中，细菌使用 Cas 蛋白破坏入侵的噬菌体 DNA。 他们通过将噬菌体 DNA 与存储在其基因组 CRISPR 阵列中的相同序列的 RNA 拷贝进行比较来识别该噬菌体 DNA。 因此，您可能想知道，为什么 Cas 蛋白最终不会切割阵列中的间隔物？

认识到“自身”DNA（细菌基因组）和“非自身”DNA（外来 DNA，如噬菌体基因组）之间的区别至关重要，因为细菌通常会在其基因组受损时死亡。 CRISPR系统能够通过依赖称为短DNA序列来避免对细菌自身基因组的有害破坏 p旋转间隔器 a相邻的 m提法或 PAM中. 这些在噬菌体 DNA 中与 CRISPR 靶标相邻，但从未在细菌 CRISPR 阵列中发现。 因此，Cas 蛋白会切割含 PAM 的噬菌体 DNA，但不会切割不含 PAM 的细菌 DNA。

我们将以 CRISPR-Cas9 系统为例更详细地解释这一点。

Cas9 通过搜索与其 CRISPR RNA (crRNA) 指南互补的任何 DNA 来工作。 一旦 Cas9 找到这样的 DNA，它就会将 DNA 分开。 由于细菌 CRISPR 阵列编码 crRNA，它们总是互补的。 PAM 要求是阻止 Cas9 切割阵列的原因。 但是怎么做？

在测试其 crRNA 是否可以与一段 DNA 碱基配对之前，Cas9 首先检查其特定的 PAM 序列：GG，两个鸟嘌呤碱基。 如果没有 PAM，Cas9 就会飘走。 即使 crRNA 包含与 DNA 序列的完美互补匹配，Cas9 也不会在没有首先看到 PAM 的情况下找到它。 当 Cas9 成功找到一个 PAM 时，它 然后 检查相邻的 DNA 是否与其 crRNA 向导匹配。 如果是这样，那么 Cas9 就知道可以切割了。 repeat-spacer 数组不包含 PAM 序列，因此 Cas9 不会对其进行切割。

为什么在噬菌体基因组中的预期目标旁边总是有一个 PAM？ CRISPR 系统在 CRISPR 免疫的第一步，即获取过程中确保了这一点。 当噬菌体将其 DNA 注入细菌时，Cas1、Cas2 和另一种称为 Csn2 的蛋白质与 Cas9 一起选择合适的噬菌体 DNA 片段（称为前间隔区）插入 CRISPR 阵列。 事实上，这些蛋白质只选择靠近 PAM 的前间隔子。 Cas1、Cas2、Csn2 的勤奋活动和 PAM 要求使细菌能够保护自己免受噬菌体的侵害，同时避免自己的 DNA 被切割。

🎥 | 为 PAM 的深入概述 及其在天然 CRISPR 免疫和 基因组编辑 应用程序，请观看下面的白板视频。

细菌已经进化出各种各样的 CRISPR 系统来保护自己。 简而言之，一个 CRISPR-Cas 系统由一组 CAS 基因和CRISPR阵列。 微生物可以有不同的组合 CAS 基因，每个独特的集合被定义为不同的CRISPR系统。 构成系统的 Cas 蛋白就像一个团队，每个人都有独特的角色，共同工作以实现目标。 想象一个体育联盟——每个人都在打同样的比赛，但并不是每支球队都是一样的。 

所有的 CRISPR 系统都包含 cas1 基因。 cas1 编码 Cas1 蛋白，该蛋白在 CRISPR 阵列中添加了新的间隔物，因此细菌可以抵御新的噬菌体。 一个 CRISPR 阵列可以有一个间隔子到数百个间隔子之间的任何位置。

系统之间有什么不同？ 对于 CRISPR 免疫的几乎每个方面，大自然都提出了一些变化。 让我们一一考虑CRISPR免疫的每一步。

• 获得 - 这一步在不同系统之间往往非常相似，但 Cas1 和 Cas2 会从各种因系统而异的其他蛋白质中获得帮助，包括其他 Cas 蛋白，有时还有未编码的宿主蛋白。 CAS 基因并在细胞中发挥其他作用。 
• crRNA生物发生 - 各种Cas蛋白将pre-crRNAs切割成成熟的crRNAs。 有时有专门的 Cas 蛋白来完成这项工作。 有时，完成干扰步骤的同一蛋白质也会处理其 crRNA。 其他时候，无关的细菌蛋白也参与其中。 处理后的 crRNA 指南的组成也可能因系统而异。 crRNA 通常是单链 RNA，可折叠成 簪 or 茎环 结构在一端。 然而，RNA 中发夹的存在、大小、形状和位置各不相同。 有时 crRNA 还需要额外的 RNA 才能充分发挥作用。 例如，常见的 CRISPR-Cas9 系统同时使用 crRNA 和称为 tracrRNA 的额外 RNA 片段。
• 干扰 - 这一步的特点是系统之间的差异最大，并作为其分类的基础。 CRISPR-Cas系统分为两大类。 1 类系统有一个大型的多蛋白监测复合体，可以发现核酸靶标。 有时这种复合物会直接切割目标，有时它会激活一种单独的切割蛋白，称为 核酸酶，或多个单独的核酸酶，用于破坏。 另一方面，2 类系统使用单一蛋白质来寻找和切割目标。 这些类别中的每一个都进一步分为类型和子类型，这些类型和子类型根据哪一组而有所不同 CAS 他们使用的基因。

  虽然我们主要讨论 CRISPRpedia 中的 DNA 靶向 Cas9 系统，但有些 Cas 酶会切割 RNA，有些系统会破坏 DNA 和 RNA。 不同的系统通常会识别唯一的 PAM。

  也许最大的可变性来自 形成一种 CRISPR系统破坏​​核酸。 这 Cas3 在 I 型系统中发现的酶沿着目标 DNA 移动，像割草机一样将其切碎。 一些监视综合体在多个地方切割同一个目标。 其他 CRISPR 酶，如 Cas9，只切割一次。 最后，一些 CRISPR 系统不会将切割限制在其匹配的目标上，而是一旦确定了目标，就开始切割附近的任何 DNA 或 RNA 片段。

随着科学家们继续研究 CRISPR 免疫和发掘新系统，越来越多的变异被揭示出来。

CRISPR 系统的数量可能是压倒性的，并且仍在发现新的系统。 为什么会进化出这么多变种？

不同的 CRISPR-Cas 系统允许细菌对不同类型的噬菌体作出反应。 例如，虽然大多数系统以 DNA 为目标，但有些系统可以切割 RNA，还有一些系统可以同时切割 RNA 和 DNA。 这很方便，因为一些噬菌体具有 RNA 基因组，甚至那些具有 DNA 基因组的噬菌体也需要在感染过程中制造 RNA。 一些 Cas1-Cas2 复合物甚至可以整合 RNA 作为新的间隔物。 

除了对不同的噬菌体做出反应之外，细菌拥有多个 CRISPR 系统作为“备份”可能会有所帮助，以防万一失败。