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CRISPR技术

科学审稿人 罗斯威尔逊

介绍 科学家如何在实验室中使用 CRISPR 工具?

科学家们已经将天然 CRISPR 蛋白重新构想为在其他生物体中操纵基因组的工具。 本 CRISPRpedia 章节介绍了各种基于 CRISPR 的工具、它们的工作原理以及它们如何用于研究。

下载图形资源 (CC BY-NC-SA 4.0)

Cas9:从自然到实验室

细菌 Cas9 蛋白已被选为基因组编辑工具,可用于任何生物体

词汇
CRISPR RNA/crRNA、双向导 RNA/dgRNA、单向导 RNA/sgRNA、细胞核、真核生物、原核生物、核定位信号/NLS、组蛋白

可编程 DNA 切割的两种不同用途

正如在讨论中 前一章, 自然有很多 CRISPR 保护系统 病毒. 但特别是一种 CRISPR 系统为生物学研究的新时代打开了大门。 这是CRISPR-Cas9,它已被重新用作改变目标的工具 的DNA 过程中的序列称为 基因组编辑. 在我们深入了解详细信息之前 基因组 编辑工作,我们将回顾 Cas9 在自然界中的工作原理以及将其用作基因组编辑工具的不同之处。 参与 CRISPR 免疫和基因组编辑的核心组件是:

  • Cas9 蛋白质 — 切割 DNA 的分子剪刀
  • A 向导RNA — 一种可定制的小型分子,可指导 Cas9 切割特定的 DNA 序列

细菌免疫和基因组编辑都依赖于 Cas9 根据其引导序列发现和切割特定 DNA 靶标的能力 RNA. 让我们看一下这两种情况之间的一些重要区别:递送、引导 RNA 组成、 CAS号 蛋白质变体,和 原核生物真核 细胞.

寄送地址

Cas9是如何进入细胞的? 在自然界中,细菌 DNA 编码 CRISPR-Cas9 系统。 但 Cas9 并非在植物或人类等复杂生物体中自然编码,也并非在所有 微生物 我们可能想研究的东西,因此研究人员必须将系统添加或“交付”到这些生物体中以进行基因组编辑。 为此,他们必须绕过细胞屏障。 研究人员以多种方式绕过这些障碍,具体取决于他们正在使用的生物类型以及他们正在尝试做什么。

在实验室中将 CRISPR 工具添加到细胞中的一些常见方法包括 转化质粒 (用于细菌)、电穿孔、化学刺激或病毒递送(用于人体细胞), 农杆菌 改造 (对于植物),和 显微注射 卵子或胚胎(用于小鼠或斑马鱼等动物模型)。

指导 RNA 组成

在自然界中,Cas9 由两个独立的 RNA 分子引导,有时称为 双向导RNA (dgRNA):

研究人员找到了一种简化这一过程的方法。 他们将 crRNA 和 tracrRNA 结合形成一个连续的分子,称为 单向导RNA (核糖核酸)。 因此,基因组编辑器只需要生成一个 RNA 即可编辑特定的 DNA 序列。

Cas蛋白变体

细菌细胞将使用它们所拥有的任何一种 CRISPR 系统来对抗 噬菌体,但研究人员不仅限于使用一个。 基本的 CRISPR-Cas9 系统可以做很多事情,但它有局限性。 认识到这一点,研究人员花费了大量时间开发 CRISPR 工具:首先,他们为基因组编辑制作了更准确的版本。 他们开发了其他 Cas 用于基因组编辑和工程化 Cas 蛋白,以使用新的切割目标 PAM 序列。 他们甚至开发了 CRISPR 系统,除了切割 DNA 之外还可以做其他事情。 您可以在后续部分中了解有关这些更改的更多信息。

原核与真核细胞

使用 CRISPR 系统编辑真核细胞(植物、动物、真菌和 徒弟) 提出了一些独特的挑战. 真核生物 将他们的 DNA 储存在一个称为 a 的结构中 . 这意味着研究人员不仅要通过细胞膜传递他们的 CRISPR 工具,还要一直传递到细胞核中。. 向 Cas9 蛋白添加一个短标签,称为 核定位信号 (NLS) 告诉细胞将酶拉入细胞核. 一旦进入,Cas9 就可以通过 DNA 搜索找到它的目标。
 
真核细胞以比细菌更复杂的方式组织它们的基因组。 他们将 DNA 包裹在称为 组蛋白. 当 DNA 是 紧紧 像这样结束,Cas9 和其他 CRISPR 酶很难实现。 这会使某些目标比其他目标更难编辑。
 
CRISPR还可以 使用 作为一种工具 原核生物 (细菌和 ). 在这种情况下,传统的编辑很困难,因为原核生物没有强大的 DNA 修复系统. 进行有针对性的切割通常会杀死细胞而不是导致基因组编辑。 研究人员可以通过使用不切穿两个 DNA 的 CRISPR 工具来克服这个问题 , 喜欢 碱基编辑器克里斯普里 (在“扩展 CRISPR 工具包").

Cas9结构功能

Cas9 核酸酶的结构变化如何使其切割目标 DNA

词汇
结构、域、识别叶/REC、核酸酶叶/NUC、HNH、RuvC、PAM 相互作用域/PID、目标链、非目标链、切割、脱靶效应

Cas9 蛋白及其工作原理之旅

CRISPR 核酸酶 像 Cas9 在多步骤过程中发现和切割 DNA 目标。 每种蛋白质都有特定的 结构体 - 一种形状或架构 - 让它发挥作用。 指导 RNA 引导每个 CRISPR 核酸酶靶向 DNA 或 RNA 序列。 请注意,由于 RNA 是用与 DNA 相同的遗传“语言”编写的,因此 RNA 和 DNA 可以 碱基对 彼此,并且指导 RNA 可以与 补充 DNA 或 RNA。

核酸酶具有各种内置的质量控制步骤,确保它只切割正确的 DNA 序列。 在这里,我们描述了这个过程如何适用于 Cas9。 许多 CRISPR 酶遵循类似的原则,但每种都有自己的怪癖,详见 前一章.

Cas9 是一种单一的双叶蛋白质,由几个动态区域组成,称为 域名. 您可以将蛋白质结构域想象成身体的不同部位——它们都相互连接并协同工作,但各自做不同的事情。 Cas9 是双叶的,因为它的结构域形成两个叶: 识别瓣 (略 REC)和 核酸酶叶 (NUC)。 这些有点像 Cas9 的“顶部”和“底部”。 这样,它的形状大致类似于蛤蜊。

REC 瓣对于携带向导 RNA 很重要。 NUC 叶包含两个独立的核酸酶结构域,称为 氨氮鲁维C. 你可以把它们想象成 Cas9“分子剪刀”的两把刀片。 HNH 域非常大且具有移动性,而 RuvC 域的动态性较低。

接下来,我们将介绍 Cas9 的每个部分如何帮助它识别和切割 DNA。

识别正确的 DNA 靶标

Pam 识别Cas9 携带一个引导 RNA,该 RNA 主要保存在其 REC 瓣中。 Cas9-gRNA 复合物搜索匹配的 DNA 序列。 搜索过程的第一步是寻找 PAM,即 Cas9 结合目标和切割所需的一小段 DNA(在 前一章)。 PAM 由核酸酶叶的一个区域识别,称为 PAM 交互域 (PID)。 来自细菌的广泛使用的 Cas9 蛋白 化脓性链球菌 识别 PAM 序列“NGG”。 其他 CRISPR 核酸酶与独特的 PAM 结合,因为它们具有不同的 氨基酸 在他们的 PAM 交互域中。

碱基配对一旦与 PAM 结合,Cas9 就会解开相邻的 DNA 双螺旋。 如果引导 RNA 与目标匹配,它将与互补 DNA 链(即 目标链). 基值- 配对总是发生在一个方向上,从 基础 紧挨着被称为种子区域的 PAM,并一直拉到引导 RNA 的末端。 碱基配对的 gRNA 和 DNA 靶链位于 REC 和 NUC 叶之间的空间中。 Cas9 挂在对面或 非目标 沿着其表面的凹槽中链,使两条 DNA 链分开。

如果没有 PAM 或相邻的 DNA 与引导 RNA 不完全匹配,Cas9 将继续前进并在别处搜索。

切割过程

完全绑定如果 Cas9 在与其向导 RNA 匹配的 DNA 区域旁边发现了一个 PAM,那么切割或 劈开 DNA 将开始。 一般情况下,Cas9 只在所有 20 核苷酸 指导 RNA 碱基对与目标 DNA 的关系。 Cas9 偶尔会忽略一些不匹配,导致 不中 乳沟。 在“改进 CRISPR 工具."

DNA 靶点切割一旦目标 DNA 大部分或完全碱基配对,HNH 结构域就会摆动到位并切割目标 DNA 链。 几乎紧接着,RuvC 结构域将自身定位以切割非目标 DNA 链。 两次切割发生在距 PAM 三个核苷酸处。 它们留下钝的 DNA 末端。 然而,RuvC 域通常会“咀嚼”非目标链,留下小的突出部分。

切割 DNA 后,Cas9 的工作就完成了。 在天然噬菌体防御中,其他酶被认为可以完全分解切割的噬菌体 DNA。 在基因组编辑过程中,细胞修复蛋白弥补了这一差距。

要查看此机制的动画版本,请查看 HHMI 的 交互式 Cas9 模块. 要详细了解 Cas9 的结构,请尝试我们的免费增强现实应用程序, CRISPR-3D.

CRISPR基因组编辑

对 DNA 进行切割如何导致切割位点的序列发生变化

词汇
基因组编辑、锌指核酸酶/ZFN、转录激活因子样效应核酸酶/TALEN、双链断裂/DSB、非同源末端连接/NHEJ、插入缺失、敲除、同源定向修复/HDR、供体DNA/模板DNA,靶向效应

科学家如何改写 DNA?

基因组编辑 是在活细胞内改变特定 DNA 序列的过程。 这可以用于各种目的,在整个 CRISPRpedia 中都有描述。

有多种基因组编辑工具可用。 例如, 锌指核酸酶 (ZFN) 以及 转录激活因子样效应核酸酶 (人才) 是出现在 CRISPR 之前的有效基因组编辑工具。 研究人员每次想要编辑新序列时都必须重新设计这些工具。 相比之下,CRISPR 基因组编辑技术以“即插即用”的方式工作,使其更加方便。

基因组编辑如何工作? 有两个关键过程:(1) 对基因组 DNA 进行靶向切割;(2) 细胞修复 DNA 以改变序列的方式断裂。

进行有针对性的 DNA 断裂

双链断裂使用 CRISPR 编辑基因组的第一步是使用引导 RNA 对 Cas9(或另一种 Cas 酶)进行编程。 研究人员将指南设计为与基因组中的特定目标序列互补。 他们将 Cas9 和他们定制的 gRNA 添加到他们想要编辑的细胞中。 Cas9 将搜索整个基因组,最终找到它的目标位点并在两条 DNA 链上进行切割,也称为 双链断裂 (DSB).

CRISPR-Cas9、ZFN 和 TALEN 都是基因组编辑技术,可以在研究人员想要的任何地方切割 DNA。 这就是为什么它们经常被描述为“分子剪刀”。 但是 DNA 断裂如何最终改变 DNA 序列呢? 让我们来看看剩下的过程。

修复 DNA 断裂的两种常见方法

在 DNA 中进行双链断裂只是基因组编辑的前半部分。 其余的由细胞来完成。 对 DNA 的损伤会杀死一个细胞,因此细胞有各种不同的修复系统来修复任何问题。 制造 DSB 会触发细胞发送一组 DNA 修复蛋白来修复断裂。

修复蛋白质关闭 DNA 断裂的最常见方法是将两个断裂的末端缝合在一起。 这通常通过一个称为 非同源词尾连接 (NHEJ)。 NHEJ 的过程可能马虎,导致修复部位的小 DNA 缺失或插入,简称 插入. 这些可以灭活或 淘汰 基因.

想象一下从句子中间删除一个单词或添加几个随机字母。 这句话可能不再有意义了。 同样,包含插入缺失的基因通常会停止工作。 用 NHEJ 破坏基因后,科学家可以观察基因敲除的影响,从而了解基因的作用。 当基因对生物体产生负面影响时,阻止基因工作也很有用,例如导致人类疾病或使植物易受病毒感染的基因变异。

一种不太常见的修复机制是细胞通过添加新的 DNA 序列来修复 DNA 断裂。 这是通过一个称为 同源定向修复 (HDR)。 通过这个过程,研究人员可以准确指定插入的 DNA 序列。 他们通常通过提供一部分 模板 or 捐赠者 脱氧核糖核酸。 为了有效修复,模板 DNA 必须包含与断裂 DNA 末端匹配的序列,称为同源序列。 以这种方式插入或替换 DNA 可以修复损坏的基因或改变细胞功能。

会发生哪种类型的维修?

控制在 Cas9 进行切割后发生哪种类型的修复可能很困难。 通过 NHEJ 制作的小插入缺失是最常见的基因组编辑结果。 添加模板 DNA 可以导致其插入到切割位点,但通常不是每次都插入,也不是在研究人员想要编辑的每个细胞中插入。 在一个实验中,在 1 个细胞中只有 1000 个插入正确就不足为奇了! DSB 还可能导致一小部分细胞中的染色体发生大的、不需要的重排或缺失,称为 目标效应.

那么科学家们是做什么的呢? 在某些情况下,研究人员可以只分离出接受了他们想要的编辑的细胞或生物体。 有时,他们添加小分子或以鼓励细胞使用 HDR 途径的方式设计模板 DNA。 科学家们也在开发 CRISPR 基因组编辑的变体,这些变体可以带来更可靠的修复结果,例如后面在“扩展 CRISPR 工具包.” 最好的策略取决于研究人员到底想做什么,还有更多创新的空间。

 

🎥 | 我们已经了解了基因组编辑的分子细节,但是对于在实验室执行该程序的人来说,现实生活中的过程是什么样的? 窥视我们的一个实验室,看看基因组编辑是如何完成的 在下面的视频。

精炼 CRISPR 工具

使基因组编辑更准确、更通用

词汇
切口酶

哪里有改进的余地?

基因组编辑实验依靠 CRISPR 工具切割特定的 DNA 位点,从而导致 DNA 序列发生变化。 CRISPR 工具使执行基因组编辑实验变得非常容易,但它们具有重要的技术限制:

  • 它们并不总是在基因组中的正确位点切割
  • 他们可以定位的网站有一些限制

正如您将在下面了解到的那样,研究人员正在寻找克服这些挑战的方法。

使基因组编辑更准确

CRISPR 工具并不总能切割正确的 DNA 序列。 有时,如果引导 RNA 和目标 DNA 之间存在部分匹配,那么酶就足以结合和切割。 在不需要的位点切割 CRISPR 蛋白质称为脱靶效应。 基因组编辑通常只想编辑他们选择的目标,因此脱靶编辑可能会导致问题。

认识到这个问题,研究人员通过改变其结构来修改 CRISPR 工具。 这些酶更善于服从它们的指导,并且很少切割错误的序列。 无论您使用哪种 CRISPR 工具,检查脱靶编辑都很重要,但使用这些“高保真”变体通常会提高准确性。 还有其他方法可以提高准确性,有时是通过修改引导 RNA 而不是调整 Cas 蛋白。

CRISPR 切口酶 以不同的方式使基因组编辑更加准确。 像 Cas9 这样的 CRISPR 酶通常会切割两条 DNA 链。 研究人员可以 变异 Cas9 的切割域之一阻止其工作,将酶转化为切口酶。 切口酶仅在一条链上进行切割,这被称为 缺口。 个人 刻痕 通常不会自行导致基因组编辑,但附近的两个缺口会。 科学家可以用两种不同的引导 RNA 加载 CRISPR 切口酶,将它们定位到靠近的 DNA 位点并触发基因组编辑。

为什么这种类型的基因组编辑会更准确? 想想用 CRISPR 工具切割 DNA 序列,比如向目标射箭。 即使是超级熟练的弓箭手也会偶尔错过目标。 但是,熟练的弓箭手不太可能以同样的方式两次错过目标。 同样,两个 CRISPR 切口酶不太可能在基因组的同一区域产生脱靶切口。 脱靶位点可以在整个基因组的任何位置,因此它们不太可能紧挨着发生。 除非两个刻痕靠近,否则不会进行编辑。 因此,使用双切口酶的脱靶编辑很少见。

使用 PAM 变体使新的 DNA 序列可编辑

常见的 CRISPR 工具可以针对许多 DNA 序列。 然而,CRISPR 工具通常要求其目标具有称为 PAM 的许可序列,在 前一章. PAM 通常很短(有时只有两个核苷酸),因此科学家通常可以在他们想要编辑的基因组位点附近找到一个。 但并非总是如此,他们可能无法找到允许 CRISPR 酶切割的 PAM 究竟 他们想在哪里进行编辑。 因此,PAM 要求限制了可靶向 DNA 序列的数量。

研究人员正在通过发现新的 CRISPR 酶或改造现有工具来绕过这些限制。 他们可以对 DNA 序列进行数字搜索,并找到具有不同 PAM 要求的 CRISPR 系统。 它们还可以改变蛋白质的 PAM 需求。 为此,他们修改了蛋白质中与 PAM 相互作用的氨基酸。 使用目前的技术,研究人员基本上可以针对任何 DNA 序列!

扩展 CRISPR 工具包

CRISPR 的可编程 DNA 靶向可以与其他有用的功能相结合

词汇
dCas9、融合、碱基编辑器、转录/转录、基因调控、激活剂、阻遏物、击倒、招募、表观基因组

将 Cas9 变成研究人员的瑞士军刀

在 CRISPR 基因组编辑过程中,研究人员通常会切割特定的 DNA 序列来进行编辑。 这种技术被用于许多令人兴奋的研究项目。 尽管如此,CRISPR 工具包有许多工具,它们的作用远不止切割 DNA。 新方法经常被发明出来,所以我们在本节中只描述少数几个关键工具。

这些工具中的大多数使用称为“死”Cas9 的非切割 CRISPR 蛋白,或 dCas9,简称。 如果说常见的 CRISPR 切割工具就像精准定位的箭头,那么 dCas9 就像是尖头钝的箭头。 dCas9 仍然可以靶向精确的 DNA 序列,但它不会切割它们。

可以将具有各种功能的蛋白质附着在 dCas9 上。 这通常是通过建立一个称为 聚变. 融合蛋白保持其原有能力,并获得 dCas9 发现并锁定特定 DNA 靶标的能力。 这就像将有效载荷绑在钝箭头上。 研究人员使用这些工具将蛋白质活动靶向特定的 DNA 序列。

使用碱基编辑器直接编辑 DNA

基础编辑器 是直接改变 DNA 碱基的 CRISPR-Cas9 系统的变体。 有天然存在的和工程化的酶可以将 DNA 序列中的单个字母转换为其他字母。 当与 Cas9 融合时,这些酶可以靶向特定的 DNA 序列。 碱基编辑器通常包括 dCas9 或 Cas9 切口酶。 这意味着没有双链断裂,碱基编辑不会激活由传统基因组编辑触发的修复系统。

因此,科学家可以使用碱基编辑器将一个 DNA 字母精确地更改为另一个。 这个过程就像突出显示文本文档中的单个字母并在一次击键中替换它。 目前,主要的碱基编辑工具允许研究人员将 A 更改为 G,将 C 更改为 T。 在设计新的和改进的碱基编辑器方面取得了实质性进展,并且可能很快就会提供更多此类工具。

上下调节基因表达

基因编码蛋白质。 为了产生编码的蛋白质,细胞首先复制或 转录 将特定基因转化为 mRNA。 然后将 mRNA 用作指导核糖体如何构建蛋白质的说明书。 一般来说,如果发生更多的转录,就会产生更多的编码蛋白质。 如果 mRNA 的转录较少,则该 mRNA 的蛋白质产物就会减少。

为了正常运作、生长和繁殖,细胞需要不断调整 它们的单个蛋白质水平。 这就是所谓的 基因调控. 为此,细胞中的调节蛋白可以上下调节基因的转录,产生更多或更少的 mRNA 拷贝和更多或更少的编码蛋白质产物。 增加转录的调节蛋白称为 活化剂, 减少转录的蛋白质是 阻遏物.

研究人员可以将这些转录调节因子中的一个或多个附加到 dCas9 上,并使用靶向目标基因的引导 RNA 对其进行编程。 当 dCas9 与其靶标结合时,调节器会向上或向下调节基因的转录。 通过这种方式,科学家可以更多地了解基因的功能。

如果完全敲除或破坏一个基因对细胞是致命的,这种方法特别有用。 研究人员可以改为减少 基因表达,被称为 撞倒 该基因通常可以让细胞存活,同时仍然提供有关该基因作用的线索。

dCas9 调节器如何实际控制转录? 在某些情况下,dCas9 被认为可以物理阻断 RNA 聚合酶等蛋白质与基因附近的结合,从而阻止转录。 有时,调节蛋白吸引或 recruit 其他影响转录的蛋白质。 也可以直接修改 表观基因组 使用 CRISPR 工具,将在下一小节中解释。

进行表观遗传修饰

细胞中的所有 DNA 都称为基因组。 这 表观基因组 是对 DNA 和包裹 DNA 的特殊蛋白质组蛋白的一组化学修饰。 这些化学标记可以影响转录、激活或抑制基因。 如果我们想象基因组是一本食谱,而基因是食谱,那么制作表观遗传标记就像在食谱上添加一个便签,上面写着“多做这个!” 或“少做!”

表观遗传修饰的影响可能很复杂,但研究人员了解制造它们的许多蛋白质。 通过将表观基因组修饰蛋白附加到 dCas9 上,科学家们可以将它们靶向特定基因,从而“上调”或“下调”表达。 它们通常在基因开始之前针对它们,在称为启动子的区域中,转录机器必须在将基因转录成mRNA之前附着在该区域中。

一些最常见的表观遗传编辑工具由与甲基转移酶融合的 dCas9 组成,甲基转移酶将甲基基团添加到 DNA 中。 DNA甲基化可以部分或完全阻止转录。 dCas9-甲基转移酶从而使基因“关闭”或“关闭”。

相反,研究人员可以使用去除甲基的 dCas9 去甲基化酶激活基因。 dCas9 也可以与乙酰化酶融合,乙酰化酶是一种将乙酰基添加到组蛋白尾部的酶。 这些乙酰标记倾向于“打开”DNA并增加转录。

直接的表观遗传编辑倾向于更完全和永久地“打开”或“关闭”基因 与上一小节中描述的 CRISPR 调节器相比,但这取决于实验设计。 科学家可以使用 表观遗传 CRISPR 编辑器 了解表观遗传修饰的复杂后果。

使 DNA 序列发光

有许多类型的蛋白质和小型化学染料会发光。 它们有彩虹的所有颜色。 最著名的荧光蛋白之一是 绿色荧光蛋白,或 GFP。

研究人员可以将荧光蛋白或染料与 dCas9 融合。 将荧光标记的 dCas9 靶向特定的 DNA 序列将使其亮起。 然后,研究人员可以使用特殊的显微镜来追踪这些序列如何与细胞的其他部分相互作用,检测其他荧光蛋白何时在同一位点结合等等。 像这样的相互作用会影响重要的细胞功能。

 

🎥 | 回顾基本的基因组编辑过程和 观看 CRISPR 工具包中的其他工具如何工作,看看下面的动画。

使用 CRISPR 进行基础研究

通过改变基因并观察发生了什么,我们可以了解这些基因的作用

词汇
基础研究、假设、假设、基因表达、基因抑制、CRISPR 激活/CRISPRa、CRISPR 抑制/CRISPRi、模式生物

通过实验学习生物学的基本事实

科学家可以就世界提出各种各样的问题,但并非所有研究都是为了解决问题而设计的。 基础研究 涉及探索自然和生物学的基本方面,以及 通常是出于好奇、敬畏和着迷。 

研究人员使用 CRISPR 工具来回答许多关于基因和基因组如何影响细胞和生物体工作方式的基本研究问题。 这种实验方式通常涉及对基因进行改变并寻找对细胞或有机体的影响。 多年来一直可以调整基因,但 CRISPR 显着加快了这一过程,并且可以对以前从未研究过的生物体进行修改。 基础研究科学家进行的基因修饰类型分为四大类:

  1. 敲除基因
  2. 调高或调低基因的影响
  3. 改变基因功能
  4. 添加新基因

下面的小节展示了研究人员如何使用这些修饰技术来了解基因。 每个小节包含两个示例。 第一个例子展示了机械师如何使用类似的技术来学习自行车的功能(用🚲表示)。 第二个例子展示了生物学研究人员如何使用该技术来了解植物基因的工作原理(标有🌺)。

打破基因以了解它们的作用

借助基于 CRISPR 的基因组编辑,研究人员可以删除或 淘汰 特定基因。 通过删除或弄乱基因序列的关键部分,他们“破坏”它,或阻止它发挥作用。 通过监测破坏基因的影响,他们获得了有关基因正常工作的线索。 例如,破坏一个基因可能会改变一个可观察到的特征。 然后可以做出有根据的猜测或 假设 那个基因控制着那个性状。 进一步的实验将完善这一假设并建立理解。

🚲 | 机械师可以使用类似的技术来了解自行车的工作原理。 机械师首先破坏自行车的刹车。 然后,机械师让一名志愿者骑自行车。 结果,志愿者很难停下来。 因此,机械师得出结论,刹车可能会使骑手停下来。 机械师正在制作 假说 ——基于观察的关于事物如何运作的想法。 一个假设可以通过更多的实验来检验,这将支持或反驳它。

🌺 | 同样,生物学研究人员了解植物基因的作用。 研究人员首先使用 CRISPR 基因组编辑来破坏特定基因。 后来,他们注意到植物的花瓣从蓝色变成了白色。 因此,他们假设该基因控制着花的颜色。 这是未来实验的一个很好的起点!

将基因的作用“向上”或“向下”

CRISPR 工具可用于激活或“调高”基因功能,例如调高电视音量。 请记住,基因是蛋白质的指令,因此激活基因意味着告诉细胞制造更多基因编码的蛋白质。 这被称为增加基因的 表达. 基因也可以被“拒绝”,因此细胞产生更少的它们编码的蛋白质。 这就是所谓的 基因压抑. 用于执行此操作的两种 CRISPR 方法是 CRISPR激活 (克里斯普拉, 调高表达式) 和 CRISPR抑制 (克里斯普里,拒绝表达)。

研究人员上下调整基因以检验关于它们的作用的假设。

🚲 | 机械师可以使用类似的技术来了解更多关于刹车的信息。 机械师可以通过在自行车上增加更多来“调高”刹车。 有了额外的刹车,机械师假设骑手会更容易停下来。

机械师为自行车增加了更多的刹车,并观看了志愿者骑行。 当他们刹车时,志愿者会更快地停下来。 刹车帮助自行车停下来。

🌺 | 生物学研究人员知道他们的基因会影响花的颜色。 他们假设调高基因功能将使他们的花朵更加丰富多彩。 他们使用 CRISPR 工具来调高基因的表达,使植物的花朵变成更深的蓝色。 这一结果为他们最初的假设提供了支持证据,即基因控制花色。 它还可以让研究人员完善他们的假设,使其更加具体。 他们现在认为该基因控制着蓝色色素的产生。 他们得出结论,开启基因的功能意味着产生更多的色素,使花朵呈深蓝色。

使用 CRISPR 工具改变基因功能

用CRISPR编辑基因序列可以改变 形成一种 基因起作用或它的作用。 如果对基因的工作原理没有一个很好的了解,就很难设计出对基因功能有特定影响的编辑。 这些信息通常来自以前的实验和观察。

🚲 | 同样,机械师可以改变刹车以了解更多关于它们的信息。 机械师知道刹车有助于骑手停下来,并注意到刹车连接到自行车的后轮。 机械师不确定这种连接是否重要。 机械师认为连接刹车可能很重要 a 车轮。 机械师假设,如果他们切换刹车以连接到前轮,自行车仍然会停下来。

机械师将制动器连接到前轮。 之后,骑手仍然可以停下来。 这一结果提供了支持机械师假设的证据。 制动器可以连接到前轮或后轮,自行车仍将停止。

🌺 | 生物学家知道一个与叶色相关的基因,该基因与他们与花色相关的基因具有相似的序列。 经过仔细检查,他们注意到基因的开头非常相似,但结尾却大不相同。 花和叶的颜色不同,因此他们推测这些基因的末端是控制颜色的部分。

为了验证这一假设,研究人员将“花色基因”的末端替换为“叶色基因”的末端。结果,花瓣变绿了!这个结果为他们的假设提供了证据。“花色基因”基因”对于赋予花朵颜色很重要,而基因的末端控制着哪种颜色的发展。

使用 CRISPR 工具为生物体添加新基因

最后,研究人员可以使用 CRISPR 技术将全新的基因插入生物体中。 当给予一个新基因时,一个有机体可能会获得一种能力。 这是基因控制能力的良好证据。

🚲 | 机械师可以通过将刹车添加到不同的车辆上来了解更多关于刹车的知识。 机械师有一辆滑板车,非常了解滑板车。 这种特殊的踏板车没有停止机制。 因此,机械师假设为踏板车增加刹车将使骑手停下来。 骑着改装滑板车的志愿者可以停下来。 这一结果为机械师的假设提供了证据。 刹车使骑手停下来。

🌺 | 生物学研究人员同样需要控制他们的实验条件。 控制前三个植物实验。 在这些实验中,研究人员直接比较了有和没有基因组变化的植物。 他们每次只看到一个变化。 因此,研究人员可以将观察到的变化归因于他们使用 CRISPR 基因组编辑所做的基因组变化。

在向生物体中添加新基因时,研究人员需要知道他们正在寻找什么效果。 然后他们可以选择一个有机体,这些影响将很容易测量。 出于这个原因,研究人员经常将新基因插入 模型生物. 这些是经过充分研究的生物,它们的生长和生物学是众所周知的。 在这些生物体中,很容易发现生物活性的变化。

例如,植物研究人员想将他们的“花色基因”插入到模型植物中。 他们假设这将使新植物的花朵变成蓝色。 将这个基因插入有蓝色花朵或没有花朵的植物中是个坏主意。 在这些植物中很难观察到任何影响!

因此,研究人员将花色基因插入开有红色花朵的植物中。 他们假设花瓣会变成紫色,因为蓝色和红色颜料都会产生。 但是,他们观察到花瓣实际上变成了蓝色。 这提供了更多证据表明该基因控制花色,并揭示了一些新的东西——来自原始植物的“蓝色”基因似乎“接管”了红花模型植物,将花瓣完全变成蓝色,而不是添加蓝色调成红色,变成紫色。 这可能是一个有趣的观察结果,可以在未来的实验中探索。

使用 CRISPR 完善假设并提高理解

请注意这些实验的结果如何相互建立。 研究人员从不了解开始。 最初的“破坏”(敲除)实验提供了关于事物如何运作的广泛线索。 后来的实验从这些广泛的线索中提出了更具体的问题。 通过这种方式,关于基因功能的假设得到了提炼。

研究人员 发现逐渐提高理解的结果。 做实验来检验假设通常会导致意想不到的观察结果,从而为科学家们提供下一步探索的新想法。 最终他们将理解到足以预测基因改造将如何改变生物体的生物学。 在过去,这是一个非常耗时的过程,但 CRISPR 技术加快了一切。 我们越来越多地了解基因和有机体的工作原理。

CRISPR屏幕

在一个大型实验中了解基因组的许多部分

词汇
遗传筛选、全基因组筛选、合并筛选、合并文库、阵列筛选、阳性选择、阴性选择、报告基因

使用 CRISPR 将基因与性状联系起来

随着时间的推移,越来越多的基因组正在被测序。 然而,即使在经过广泛研究的生物体中,我们仍然不知道所有基因的作用或某些 DNA 序列如何帮助控制基因表达。 使用 CRISPR 工具,我们可以编辑基因以了解它们编码的蛋白质。 研究人员很容易使用 CRISPR 工具编辑单个基因。 识别负责细胞特征的未知基因要困难得多。 研究人员可以一个一个地编辑和测试每个基因——但这需要很多时间。

基因筛选 提供更快的替代方案。 研究人员使用 CRISPR 工具在一次实验中筛选许多基因。 “屏幕”一词的意思是系统地搜索或测试。 当应用于 CRISPR 技术时,筛选允许研究人员系统地测试基因。

汇集 CRISPR屏幕 允许研究人员一次测试数以万计的基因目标。 因为可以在一次实验中修改如此多的 DNA 靶标,包括所有 人类基因组中约 20,000–25,000 个基因, 这些通常被称为 全基因组 屏幕。

在合并的 CRISPR 筛选中,研究人员提供 CRISPR 蛋白和 图书馆 大量细胞的引导 RNA (gRNA)。 就像一个真正的图书馆包含许多不同的书籍一样,gRNA 图书馆是许多 gRNA 的混合物——这些小型、可定制的分子将 CRISPR 蛋白(如 Cas9)引导至特定的 DNA 靶标。

研究人员将适量的 Cas9 和引导 RNA(通常通过引入编码它们的 DNA 来添加这些成分)添加到混合物中,以确保平均而言,每个细胞内最终只有一个 gRNA。 目的是查看一次修改一个基因的效果,而不是当 CRISPR 酶改变单个细胞中的多个基因时可能发生的复杂效果。

然后,研究人员在特定条件下培养所有细胞,只允许表现出某种特征的细胞存活。 这种故意杀死混合群体中的一部分细胞的过程称为“选择”。 选择揭示了 CRISPR 修饰是否影响特定性状。 然后,研究人员通过对剩余的 gRNA(或编码 gRNA 的 DNA)进行测序来识别受影响细胞中的靶基因。 在死亡的细胞中,所有的 RNA 和 DNA 都被破坏,不会出现在测序结果中。 确实出现的 gRNA 序列一定来自存活的细胞,研究人员可以查看这些 gRNA 所针对的基因。 这些基因可能与感兴趣的性状有一些生物学联系。 他们甚至可能直接导致它。 我们将在接下来的小节中更详细地介绍选择和分析。

与池化屏幕不同,在 排列 CRISPR屏幕, 基因被一个一个地靶向,但许多是平行测试的。 细胞被保存在多孔板的单独“孔”中,并在每个孔中测试一个基因靶标——基本上,研究人员不是使用单个细胞培养皿,而是使用一个内部有多个独立杯子的培养皿,几乎就像几十个单独的试管全部用胶带粘在一起形成一个块。 这让他们可以同时对单个 DNA 靶标进行许多实验。 阵列 CRISPR 筛选使用较少,通常仅限于一次测试数十或数百个目标,因此我们在本节中重点描述全基因组的汇集筛选。

CRISPR筛选可能涉及对DNA进行直接编辑,例如敲除一个基因。 它们还可以进行更细微的修改,例如降低基因表达,如“扩展 CRISPR 工具包“ 以上。 有时研究人员甚至不想直接靶向基因——他们可能会使用 CRISPR 筛选来研究基因组中的“非编码”序列,这些序列不编码蛋白质,有时 被误导为“垃圾DNA”。 这可以帮助揭示诸如基因如何被调节之类的事情。

选择和分析 CRISPR 筛选的结果

研究人员需要简单的方法来检查在合并的 CRISPR 筛选中修饰的细胞。 我们可以将这些研究人员视为淘金者。 他们必须确定一个矿(实验)是否有黄金(影响感兴趣性状的目标基因)。 他们还想限制他们必须筛选的污垢(细胞)的数量。

选择是分析大量细胞的好方法。 选择有两种口味:

在一个 正选择,如果基于 CRISPR 的修饰不影响感兴趣的特征,细胞就会死亡。 当目标修饰确实影响感兴趣的性状时,细胞就会存活。 研究人员只需要检查存活的细胞即可找到影响感兴趣特征的基因。 这就像一个淘金者得到了该地区所有充满黄金的采矿点的地图。

例如,假设研究人员想要找到增加细菌抗生素耐药性的基因。 他们能 使用CRISPR工具激活 一批细菌细胞中有许多不同的基因,其中每个细胞只有一个基因被 CRISPR 工具激活。 对于阳性选择,他们可以尝试用抗生素在培养皿上培养细菌。 通常,所有的细菌都会死亡。 生长的细菌能够抵抗抗生素。 这意味着在这些幸存细菌中激活的基因可能会增加抗生素耐药性。 后续实验可以证实这一点,并揭示这些基因如何增加抗生素耐药性。

在一个 否定选择,如果基于 CRISPR 的修饰影响感兴趣的特征,细胞就会死亡。 当目标修改完成时,细胞会存活 不能 影响感兴趣的特质。 但是你不能分析死细胞,那么你怎么知道哪些基因被靶向到了现在已经消失的细胞中呢? 研究人员希望了解哪些指导 RNA 序列 ,那恭喜你, 仍然存在,并在多步骤过程中向后工作:

  • 首先,他们创建了一个他们用 gRNA 文库靶向的所有基因的列表。
  • 然后他们创建了一个列表,列出了所有靶向存活细胞的基因。
  • 最后,他们从第一个列表中减去第二个列表。 靶向死细胞的基因仍然存在。 这些基因可能会影响性状。

这就像一个淘金者得到一份所有采矿地点的清单, 缺乏 金子。 探矿者可以使用此列表来确定哪些站点 do 有黄金。 他们只需要参考另一个列表 所有 首先是矿场。 这需要额外的步骤,但它仍然比单独检查每个地雷要快。

例如,假设研究人员想要找到让细菌吃某种特定糖的基因。 他们可以使用 CRISPR 蛋白和 gRNA 文库来灭活细菌细胞培养物中的许多不同基因,其中每个细胞只有一个基因被抑制或敲除。 对于负选择,他们可以尝试在以糖为唯一食物来源的盘子中培养细菌。 大多数细菌会存活下来,但那些死去的细菌不再能够使用这种糖作为食物来源。 这意味着在这些细菌中失活的基因可能参与了糖的消化。 后续实验可以验证这些发现并揭示这些基因如何使细菌能够吃糖。

有时选择是不可能的,但研究人员可能有快速的方法来检查每个修改过的细胞。 在这些情况下,CRISPR 筛选仍然可行。 例如,如果基因靶向影响感兴趣的特征,细胞可能会发出荧光或“发光”。 这可以使用 记者 类似绿色荧光蛋白的分子. 研究人员可以使用各种类型的实验室设备来分离发光细胞。 然后他们可以识别这些细胞中的目标基因。 这些基因可能会影响感兴趣的特征。 这就像淘金者使用篦子从泥土中筛选黄金一样。 探矿者不必用手检查所有的泥土,但必须将它们全部穿过格栅。

在最坏的情况下,研究人员必须繁琐地检查每一个细胞。 如果他们正在研究需要微观研究的特征,这可能会发生。 对于大型 gRNA 文库,这种检查是不切实际的。 这就像淘金者用手在矿井中筛选所有泥土一样。 仅当只有少量污垢时才实用。

细菌中的示例 CRISPR 筛选

让我们浏览一个假设的 CRISPR 屏幕,下面将详细说明。

想象一下,研究人员想通过吃一种叫做阿斯巴甜的糖来找到让细菌生长的基因。 他们可以使用一组指导 RNA 来抑制(拒绝转录)细菌中的许多不同基因,抑制每个细菌细胞中的一个基因。

接下来,研究人员将细菌转移到含有阿斯巴甜作为唯一食物来源的生长培养基中。 含有抑制对阿斯巴甜生长重要的基因的 gRNA 的细菌应该 不能 增长,所以这是负选择。

通过识别在阿斯巴甜上生长的细菌中剩余的所有 gRNA,研究人员还可以确定哪些 gRNA 缺失。 通过稍后检查这些 gRNA 靶向的基因,他们可以创建一个候选基因列表,这些基因可能对阿斯巴甜的消化很重要。 这些基因可以单独重新测试,并在未来的实验中进行更多探索。

CRISPR 筛选支持的研究

研究人员出于多种原因使用 CRISPR 筛选。 他们最近的一些用途包括识别人类基因:

  • ...影响 HIV 感染。 了解人类基因如何影响 HIV 感染可能会促成新的治疗方法。 了解更多>
  • ……对 沙眼衣原体 感染。 沙眼衣原体 是一种细菌。 它是性传播感染的主要原因。 理解 沙眼衣原体 感染可能会导致新的和改进的治疗方法。 了解更多>
  • ...癌症 细胞依赖。 像急性髓性白血病这样的癌症可以通过化疗进行治疗,但并不总是有效。 如果我们了解对癌症生长和扩散很重要的基因,我们或许能够设计出针对这些基因的新药。 了解更多>

基因驱动

词汇
基因驱动

使用CRISPR打破经典遗传学规则

想象一下,一个十几岁的少年逼着她的一位父母寻求建议。 接下来,她就同一件事向另一位父母征求意见。 在某些情况下,他们的建议是相同的,但通常她会得到两条不同的建议。 

基因以类似的方式工作。 你有两套完整的基因——一个来自每个亲生父母。 有时基因对是相同的,但你经常会得到同一个基因的两个不同版本。 您特定的基因组合是使您成为自己的一部分。

现在想象一下,这个青少年和她的父母坐下来,同时向双方寻求建议。 在某些情况下,他们会同意。 其他时候,父母一方会凌驾于另一方之上,而女儿只需要听取他们的建议。

基因驱动 像后一种情况一样工作。 他们打破了遗传学的正常规则。 如果一个有机体从一个亲生父母那里继承了一个基因驱动,而从另一个亲生父母那里继承了一个正常基因,则该基因驱动将覆盖并取代正常基因。 他们保证将基因驱动传递给他们的后代,在那里将重复替换过程。

科学家可以使用 CRISPR 工具来创建基因驱动。 基因驱动通过寿命短的有性繁殖生物种群传播选定的基因。 例如,科学家可能会使用基因驱动将基因传播给许多蚊子,以阻止它们传播 疟疾. 虽然基因驱动在人类身上效果不佳,但它们具有改善人类福祉的潜力。 然而,它们产生广泛影响的潜力伴随着可能的生态影响和伦理问题。 开发人员和受影响的社区必须在部署基因驱动之前考虑这些影响。

CRISPR基因驱动

有自然的基因驱动,但这些很难重新设计。 CRISPR 工具让研究人员可以根据自定义目的制作新的基因驱动器。 CRISPR基因驱动器以下列方式工作:

  1. 研究人员生成了携带基因驱动的初始生物体,其中包括 CRISPR 核酸酶基因、引导 RNA,通常还有“货物”或“有效载荷”基因。 货物可以是外来基因,但通常是生物体天然存在的基因之一的编辑版本。 
  2. 研究人员让基因驱动有机体与未经修饰的有机体交配或繁殖。 因此,后代将获得 染色体 携带基因驱动(来自基因驱动蚊子)和染色体的另一个副本(来自未修饰的蚊子)将携带正常版本的基因。
  3. 产生 CRISPR 核酸酶和指导 RNA 并将它们组装在一起。 引导 RNA 指导 CRISPR 蛋白在所需的目标位点进行切割,这通常是货物基因的未改变版本。
  4. 细胞通过粘贴整个基因驱动来修复切割,因为基因驱动组件周围的 DNA 与切割位点的序列同源(有关同源定向修复的概述,请阅读“CRISPR 基因组编辑”部分)。 结果,基因驱动取代了货物基因的其他版本。 后代现在将在染色体的两个副本上携带基因驱动。
  5. 未来的后代继承基因驱动,并重复替换过程。 货物基因世代相传,在人群中迅速传播。

基因驱动的用途及其局限性

基因驱动可以将所需的基因或特征传播给群体的所有成员。 例如,基因驱动可能会使所有蚊子摆脱导致疟疾的寄生虫。 或者,它们可能会使某种杂草对除草剂敏感。 它们甚至可能使危险物种不育,最终导致灭绝。

这些应用程序令人兴奋,但它们有两个主要限制:

  1. 基因驱动仅通过繁殖的生物传播 . 它们对许多类型的细菌和其他无性生物无效。
  2. 基因驱动只传播给后代。 因此,种群级别的应用在寿命短的生物体中是实用的,但在寿命长的生物体中则不然。

基因驱动有可能产生巨大的社会影响

如果部署,基因驱动可以改变整个物种。 它们还将影响与物种共存的人类社会,将它们用于食物或实际目的,或尊重它们。 此外,影响一个物种可能会对整个生态系统产生不可预见的连锁反应。

为了合乎道德地使用基因驱动,研究人员必须向可能受到影响的社会传达部署风险和收益。 然后,这些学会应该决定是否部署基因驱动。

在某些用例中,受影响的社会可能包括多个国家、整个大陆,甚至整个世界,具体取决于某个物种的发现地点。 这样一个多元化的社会不太可能达成共识,因此基因驱动的行星规模应用不太可能。

在小型可控环境中负责任地部署基因驱动可能更可行。 例如,研究人员可能会部署基因驱动来根除小岛上的害虫。 在这些情况下,意外基因驱动传播的机会非常小。 因此,当地社会可能会同意基因驱动的部署。

基因驱动控制机制

围绕基因驱动的一些担忧包括:

  • 对基因组编辑的道德、哲学或精神上的反对
  • 意想不到的生态影响
  • 超出预期的生态系统

研究人员必须通过公开对话来解决第一个问题,寻求分享科学理解,而不是强加个人意见。 研究人员可以使用控制机制解决后两个问题。 这些为基因驱动传播“刹车”。

基因驱动控制机制包括:

  1. 限制基因驱动遗传 - 研究人员正在开发“菊花链基因驱动”。 这些使用有限的“基因燃料”在少数几代人中传播。 他们可以处理仅限于小地理位置的问题。
  2. 为继承创造障碍 - 可以对有机体进行基因改造,这样基因驱动就不会影响它。 对基因驱动“免疫”的生物可以成为基因驱动传播的障碍。
  3. 用另一种基因驱动覆盖一个基因驱动 - 基因驱动可能会导致意想不到的问题。 在这种情况下,研究人员或许能够释放一种新的“逆转”基因驱动,从而破坏原有的基因驱动。

有了这些机制,我们就有更大的能力控制基因驱动,以应对基因驱动的意外或不想要的结果。 请注意,这些控制仍然通过大规模基因改造发挥作用,因此它们还需要社会批准才能部署。 

到目前为止,基因驱动一直被极其谨慎地对待。 目前尚不清楚基因驱动是否会在研究环境之外使用。