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钝化 CRISPR 的“剪刀”让我们对自身免疫性疾病有了新的认识
钝化 CRISPR 的“剪刀”让我们对自身免疫性疾病有了新的认识
加州大学旧金山分校新闻中心 | 皮特·法利 | 30 年 2017 月 XNUMX 日
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新方法允许“20,000 个平行实验”来寻找 基因 活化剂
我们每个人 细胞 有相同的 22,000 个左右的基因 基因组,但每个都使用相同基因的不同组合,根据角色和情况的需要打开和关闭它们。 正是这些图案 表示 以及决定每个细胞会变成什么样的细胞——肾脏、大脑、皮肤、心脏——的被抑制的基因。
为了控制这些转变模式,我们的基因组包含调控序列,这些调控序列可以响应特定的化学线索打开和关闭基因。 其中包括“增强子”,即可以远离基因数万个遗传字母的序列,但在激活时仍会迫使其超速运转。 这种微妙的编排中的失误可能导致细胞承担错误的角色,导致使人衰弱的疾病,但涉及的调节区域很难找到和研究,因为它们只在特定的细胞中发挥作用,通常是在非常特定的条件下。
现在,由加州大学科学家领导的研究小组使用了基因编辑技术的改进版本 CRISPR 寻找增强器——不是通过编辑它们,而是通过促使它们采取行动。 正如 30 年 2017 月 XNUMX 日在线报道的那样 自然,来自加州大学旧金山分校和加州大学伯克利分校的一个团队使用了一种名为 CRISPR激活 (CRISPRa) 于 2013 年在加州大学旧金山分校开发,旨在寻找影响免疫细胞发育的基因的增强子,称为 T细胞. 他们发现的序列阐明了自身免疫性疾病的基本回路,如炎症性肠病 (IBD) 和克罗恩病。
这项工作是在实验室进行的 亚历山大·马森,医学博士,博士,加州大学旧金山分校微生物学和免疫学助理教授,和 雅各布玉米,博士,伯克利分子和细胞生物学助理兼职教授。
“我们现在不仅可以找到这些监管区域,而且我们可以快速轻松地找到它,这令人兴奋,”康说。 “以前要找到一个人需要数年时间,但现在一个人只需几个月就可以找到几个人。”
Corn是Innovative的联合创始人兼科学总监 基因组学 研究所 (IGI),伯克利加州大学旧金山分校的一项倡议,马森是其附属成员。 IGI 旨在推进基于 CRISPR 基因组编辑 在医学和农业领域,以治愈人类疾病、消除饥饿和保护环境。 今年 XNUMX 月,马森被纳入了 Chan Zuckerberg Biohub Investigators 的创始小组,该小组由加州大学旧金山分校、伯克利分校和斯坦福大学的研究人员组成。
CRISPRa 打开增强子
CRISPR 的出现使研究人员在理解方面取得了快速进展 蛋白质-编码基因。 在 CRISPR 最常见的应用中, 酶 被称为 Cas9 剪 的DNA 在由“的序列指定的特定序列向导RNA。” 使用该技术,科学家可以切除或编辑任何基因,并观察这些变化如何影响细胞或整个生物体。
但是直接编码蛋白质的序列只占我们基因组的 2%。 遍布其他 98% 的增强子和其他调节性 DNA 元件更难研究,但与大量遗传疾病有关。 科学家可以根据它们如何与结合 DNA 的蛋白质相互作用来寻找潜在的增强子序列,但找出哪些增强子与哪些基因一起工作更具挑战性。 简单地用 CRISPR-Cas9 去除增强子并没有帮助,因为如果增强子在实验中使用的特定细胞类型中没有活性,它不会产生明显的效果。
如果您将基因组视为具有 22,000 个灯泡(基因)和数十万个开关(增强子)的样板房,那么挑战就是找到所有开关并弄清楚它们控制哪些灯泡以及何时控制。 以前,CRISPR 已被用于切断电线,寻找那些会导致灯泡变暗的电线,从而很好地了解电路的该部分在做什么。 但是,在关闭灯开关时切断灯开关并不能告诉您有关它控制什么的任何信息。 因此,为了找到某些光开关,通常会尝试模仿激活增强子的复杂化学线索。
但使用这种方法,“你可能很快就会发疯,试图找到一种增强剂,”伯克利玉米实验室的博士后研究员、该研究的主要作者之一本杰明戈文说。
更好的方法是通用“开启”开关,它可以针对基因组的任何部分,如果该部分包含增强子,则可以激活该增强子。 幸运的是,最近开发的 CRISPra 乔纳森·魏斯曼UCSF 细胞和分子药理学教授、IGI 联合主任博士,就是这样一个工具。 CRISPRa 使用“钝化”版本的 DNA 切割 Cas9 蛋白,绑在激活蛋白链上。 虽然 CRISPra 也使用了指南 RNA 为了靶向基因组中的精确位置,而不是切割 DNA,CRISPRa 可以激活该区域的任何增强子。
虽然 CRISPra 的第一个应用涉及使用 单向导RNA 为了找到启动子——紧邻有助于启动它们的基因的序列——这项新研究背后的加州大学旧金山分校/伯克利团队意识到,CRISPRa 也可以帮助找到增强子。 他们推断,通过将 CRISPra 复合物靶向数千个不同的潜在增强子位点,他们将能够确定哪个具有开启特定基因的能力,即使该基因远离增强子上的增强子。 染色体.
“这是看待非编码调控序列的一种根本不同的方式,”加州大学旧金山分校马森实验室的博士生、该研究的另一位主要作者 Dimitre Simeonov 说。
一次做 20,000 次实验
该团队选择研究的基因产生一种称为 IL2RA 的蛋白质,它对称为 T 细胞的免疫细胞的功能至关重要。 根据身体状况,T 细胞具有触发炎症或抑制炎症的能力。 IL2RA 基因产生一种蛋白质,告诉 T 细胞是时候戴上抗炎帽子了。 如果应该打开基因的增强子出现错误,细胞就无法抑制炎症,从而可能导致自身免疫性疾病,如克罗恩病。
为了追踪控制 IL2RA 的增强子的位置,加州大学旧金山分校和伯克利分校的团队生产了 20,000 多种不同的向导 RNA,并将它们放入带有修饰 Cas9 蛋白的 T 细胞中。
“我们基本上同时进行了 20,000 次实验,以找到所有开启该基因的序列,”Marson 说。
果然,用 CRISPRa 靶向某些序列会增加 IL2RA 的产生,从而产生可能对调节 T 细胞命运很重要的位置的简短列表。
“每当你有机会以一种全新的方式提问时,你就会突然发现一些用旧方法可能会错过的东西,”Gowen 说。 “我们发现了这些增强子,而无需对它们的外观做出任何假设。”
将突变增强子与炎症性疾病联系起来
该团队确定的一个可能的增强子序列包括一个常见的遗传变异位点,该位点已知会增加 IBD 的风险,但尚不清楚它是如何做到的。 Marson 和 Corn 的团队想知道这种遗传变异是否会改变调节 T 细胞中存在的 IL2RA 蛋白数量的开关。 为了测试这一点,他们修改了小鼠 T 细胞,使其包含与人类疾病相关的遗传变异,并发现这些 T 细胞确实产生较少的 IL2RA。
“这开始解开免疫细胞调节的基本回路,这将大大增加我们对疾病的了解,”马森说。
该团队接下来希望扩展该方法,也许是通过找到同时寻找许多不同基因增强子的方法,从而更快地寻找免疫紊乱的调节因子。 他们希望该方法能够成为一种广泛适用的工具,用于解开各种细胞中的遗传相互作用。
“我们相信这将是一种非常有用的方法,”康说。 “对神经元或任何其他细胞类型感兴趣的人很容易找到它并寻找参与编程这些细胞行为的增强子。”