最小的生命形式拥有最小的 CRISPR 系统

伯克利新闻 | 罗伯特·桑德斯 | 18 年 2018 月 XNUMX 日

正如 IGI 科学家今天报道的那样 科学，一个古老的群体 微生物 包含一些地球上最小的生命形式也有最小的单一生命形式 CRISPR 迄今为止发现的效应器。

小便 蛋白质 机械，被称为 Cas14, 只与三分之一的大小有关 Cas9 蛋白质，革命的商业终点 基因- 编辑工具 CRISPR-Cas9。 虽然 Cas9 是从 菌, Cas14 被发现在 基因组 一组 古 – 细菌的原始亲戚 – 包含一些最小的 细胞 和已知的最小基因组。

Cas9等 CAS号 蛋白质是微生物进化的防御系统的一部分，以保护自己免受 病毒. 都是有针对性的 酶 寻找并非常有选择性地绑定到特定的 的DNA or RNA 序列——在微生物中，那些与早期病毒感染后存储在其 CRISPR 记忆库中的序列相匹配的微生物——然后切割 DNA 或 RNA 以禁用新的入侵者。

与 Cas9 一样，Cas14 具有作为生物技术工具的潜力。 由于其体积小，Cas14 可用于编辑基因。 但随着其 单链 DNA 切割活动，更有可能改进目前正在开发的针对传染病、遗传病的快速 CRISPR 诊断系统 突变 和 癌症.

“对于分子诊断，你希望能够靶向双链 DNA、单链 DNA 和 RNA，”加州大学伯克利分校的研究生、报告这一发现的论文的第一作者 Lucas Harrington 说。 “Cas12 非常擅长双链DNA识别， Cas13 非常擅长单链 RNA 识别，现在 Cas14 完善了这一集：它非常擅长单链 DNA 识别。”

Cas14 与 Cas12 和 Cas13 的相似之处在于，在与其目标 DNA 序列结合后，它开始不加选择地切割细胞内的所有单链 DNA。 相比之下，Cas9 仅结合和切割目标 DNA。

随意切割 DNA 在治疗中可能是一个缺点，但在诊断中却是一个巨大的优势。 Cas14 蛋白可以与附着在一段单链 DNA 上的荧光标记配对。 当 Cas14 与其目标 DNA 序列（癌症基因或传染性细菌中的基因）结合并开始切割 DNA 时，它也会切割与标记物相连的 DNA，从而产生荧光信号。

详细了解科学家如何使用 CRISPR 酶来诊断感染和疾病。

“Cas14 以比 Cas12 更具体的方式靶向单链 DNA，”Harrington 的同事 Janice Chen 补充道，她最近获得了博士学位。 来自加州大学伯克利分校。 “这真是一个出乎意料的发现。 因为它太小了，我们几乎没有想到它可以工作，但实际上它是超级特异性的，这使得它也是诊断工具箱的一个非常强大的补充。”

Harrington、Chen 和他们的同事，包括 CRISPR-Cas9 发明者 Jennifer Doudna，加州大学伯克利分校的分子和细胞生物学和化学教授，已经使 Cas14 与他们的诊断系统一起工作，称为 DETECTR，现在使用 Cas12 和 Cas13 快速检测传染性生物和基因突变的存在。 Harrington、Doudna 和 Chen 是 Mammoth Biosciences 公司的联合创始人，该公司正在将 DETECTR 商业化。

发现将被报告 在线 18 月 XNUMX 日在期刊印刷出版之前 科学. Doudna 是霍华德休斯医学研究所的研究员和创新项目的联合主任 基因组学 研究所。 Banfield 是 IGI 的微生物学负责人。

挖掘宏基因组

Cas14 蛋白是由共同第一作者 Harrington 和现任以色列特拉维夫大学教授的 David Burstein 在加州大学伯克利分校的同事过去 15 年创建的微生物基因组数据库中寻找 Cas 变体时发现的。由地球和行星科学以及环境科学、政策和管理教授 Jill Banfield 领导的团队。 数以万计的基因组是通过以下方式获得的 宏基因组 对来自各种外来环境的样本中的所有 DNA 进行测序。 Cas14 是在古细菌基因组中发现的，该基因组是从从科罗拉多州步枪的有毒清理场获得的地下水样本中测序的。

两年前，Harrington 和 Burstein 在挖掘宏基因组数据库时发现了其他小的 Cas 蛋白 CasX 和 CasY。

Cas14 大小只有一半——在 400 到 700 之间 氨基酸 长度 - CasX 并且比所有其他已知的 Cas 系统小，其长度范围为 950 到 1,400 个氨基酸。

“偶然地，我们发现了这些非常小的蛋白质，其他人只是将它们扔掉，因为它们看起来不像以前已知的 CRISPR 系统。 它们太小了，”哈灵顿说。 “我们决定，到底是什么，让我们试一试。 我们对其进行了测试，发现这些是真正的功能系统时，我们感到非常震惊。”

在数据库中找到 Cas14 的基因只是一个开始。 迄今为止，大多数 Cas 蛋白都在细菌中发现，因此在标准实验室细菌中效果很好， E。大肠杆菌. 但 Cas14 来自古细菌——以及一组最小的古细菌，称为 DPANN。 所有 Cas 蛋白都包含用于靶向和结合的 RNA 位，但 Cas14 不适用于 CRISPR-Cas9 RNA，因此该团队还必须从数据库中找出 Cas14 必须存在的两种 RNA 才能发挥作用。

此外，DPANN 古细菌不能在实验室中生长——它们似乎是寄生的，或者在某种程度上依赖于其他更大的古细菌——因此研究人员必须在试管中创造合适的环境。

Harrington 说，与其起源于更原始的微生物一致，瘦身的 Cas14 似乎是更大、更复杂的 Cas9 和 Cas12 蛋白的更原始版本，暗示这些分子已经进化了亿万年，变得更加专业化。 研究人员希望从这些原始 Cas 蛋白中学习，它们是 Cas 酶的基本成分，以便他们能够设计出最紧凑、最时尚的基因切割器。

Harrington 指出，宏基因组挖掘发现了各种版本的 Cas14，这些版本可能被证明是有用的生物技术工具。 “令人惊奇的是……这些系统是多么多样化，”他说。 “我们已经描述了 40 多种新的 CRISPR-Cas14 系统和八种不同的亚型。 这为研究这些新的 CRISPR 系统打开了闸门。”

Harrington、Burstein、Chen、Doudna 和 Banfield 的合著者是加州大学伯克利分校的 Enbo Ma、Isaac Witte、Joshua Cofsky 以及加州核桃溪能源部联合基因组研究所的 David Paez-Espino 和 Nikos Kyrpides。

这项工作由美国国家科学基金会、美国能源部、IGI 和艾伦研究所资助。