细胞工程突破：无需病毒载体的高产 CRISPR
科学家开发出一种新方法，可以产生足够的细胞用于治疗应用
CRISPR-Cas9 的新变体 基因 编辑系统使重新设计大量细胞用于治疗应用变得更加容易。这种方法由 IGI、Gladstone 研究所和加州大学旧金山分校的研究人员开发，让科学家们能够引入特别长的 的DNA 将序列以极高的效率传输到细胞基因组的精确位置，而无需传统上用于将 DNA 带入细胞的病毒输送系统。
“多年来，我们的目标之一就是将冗长的 DNA 指令放入 基因组 不依赖病毒载体，”他说 亚历克斯·马森，医学博士，博士， IGI 人类健康主任、格拉德斯通-加州大学旧金山分校基因组免疫学研究所所长、新研究的资深作者。“这是朝着下一代安全有效的 细胞 疗法”。
在杂志上发表的新论文中 自然·生物技术“, Marson 和他的同事不仅描述了这项技术，还展示了如何使用它来生成具有对抗多发性骨髓瘤潜力的 CAR-T 细胞，多发性骨髓瘤是一种血液 癌症以及重写基因序列，其中突变可能导致罕见的遗传免疫疾病。
“我们表明，我们可以在一次运行中设计超过 XNUMX 亿个细胞，这远高于我们治疗个体患者所需的细胞数量，”第一作者、IGI 研究的医学博士 Brian Shy 说马森实验室的临床研究员。
这项新研究的第一作者 Brian Shy 和他的同事开发了一种新的基于 CRISPR 的方法，可以产生足够的细胞用于治疗应用。
从双链到单链 DNA
CRISPR-Cas9 是一种编辑活细胞内基因的系统，在过去十年中一直被用作基础研究工具。 越来越多的临床科学家对 CRISPR-Cas9 产生活细胞疗法的潜力感到兴奋。
通过基因编辑，人们可以关闭、删除或替换突变的致病基因，或增强免疫细胞的抗癌活性等。 虽然 CRISPR-Cas9 的第一个治疗应用最近已进入临床试验，但该技术仍然受到安全制造大量正确编辑细胞的挑战的限制。
“这项技术有可能使新的细胞和基因疗法更快、更好、更便宜。”
传统上，研究人员依靠病毒载体（不带致病成分的病毒外壳）来携带用于 基因治疗 进入细胞。然而，大量生产临床级病毒载体一直是将细胞疗法提供给患者的主要瓶颈。此外，研究人员无法轻松控制传统病毒载体在基因组中插入基因的位置。
“使用病毒载体既昂贵又耗费资源，”Shy 说。 “基因工程非病毒方法的一个主要好处是我们不受成本、制造复杂性和供应链挑战的限制。”
2015 年，Marson 团队与 CRISPR 先驱 珍妮弗·杜德娜 ——首先表明他们可以 在没有病毒载体的情况下将短 DNA 模板插入免疫细胞， 使用使细胞外膜更具渗透性的电场。 到 2018 年，他们开发了一种方法 剪切和粘贴更长的 DNA 序列 用 CRISPR 进入免疫细胞。
然后，在 2019 年，研究人员发现， 使用可与 Cas9 酶结合的 DNA 模板的修改版本-相同 蛋白质 在 CRISPR 基因编辑过程中充当分子剪刀——它们可以更有效地将新序列传递到目标基因组位点。
然而，需要做更多的工作来提高成功工程化免疫细胞的产量，并使该过程与未来细胞疗法的制造兼容。 这些目标激发了团队当前的研究。
DNA 可以以单链或双链形式存在（就像 Velcro 的相对部分），并且 Cas9 附着在双链 DNA 上。研究人员很快发现，高浓度的双链 DNA 模板会对细胞产生毒性，因此该方法只能使用少量的模板 DNA，导致效率低下。
Marson（右）和他的团队开发的新方法可以将基因编辑的效率提高一倍，并增强治疗向细胞的传递。 此处与 Gladstone 的研究科学家 Ujjwal Rathore（左）合影。
研究小组知道，即使在相对较高的浓度下，单链 DNA 对细胞的毒性也较小。 因此，在新论文中，他们描述了一种附加修改后的 Cas9 的方法 酶 通过在末端添加一个小的双链 DNA 突出端来连接到单链模板 DNA。
“这为我们提供了一种平衡的、两全其美的方法，”Marson 说。
与旧的双链方法相比，单链模板 DNA 可以将基因编辑效率提高一倍以上。 分子的双链末端让研究人员可以使用 Cas9 来增强非病毒载体向细胞的传递。
“这项技术有可能使新的细胞和基因疗法更快、更好、更便宜，”新工作的作者、加州大学旧金山分校实验室医学助理教授 Jonathan Esensten 博士说。格莱斯顿的附属调查员。
通往诊所的道路
在这项研究中，研究人员利用新的 DNA 模板生成了超过十亿个针对多发性骨髓瘤的 CAR-T 细胞。CAR-T 细胞具有免疫 T细胞 经过基因改造，可以有效对抗特定细胞或癌症。有了新的单链 Cas9 定向模板，大约一半的 T 细胞获得了新基因，因此转化为 CAR-T 细胞。
“我们知道将 DNA 模板靶向基因组中的特定位置，称为 TRAC 位点，将提高 CAR-T 细胞的抗肿瘤效力，”该研究的合著者 Justin Eyquem 博士说。 Gladstone 的新论文和附属调查员。 “这种新的非病毒方法使我们能够更有效地实现这一目标，这将加速下一代 CAR-T 细胞疗法的开发。”
此外，研究人员表明，他们的方法首次可以完全替换与罕见遗传免疫疾病相关的两个基因，即 IL2RA 和 CTLA4 基因。
Shy 和他的同事表明，他们的方法可以作为一种“一刀切”的方法来治疗许多具有不同突变的患者，而不是需要针对每个患者进行个性化治疗。
过去，科学家已经证明他们可以替换特定患者发生突变的 IL2RA 基因的小片段。现在，Marson 的团队证明他们可以一次性替换整个 IL2RA 和 CTLA4 基因——这是一种“一刀切”的方法，可以治疗许多基因突变不同的患者，而不必为每个患者的基因生成个性化模板 突变. 经过这种基因工程方法处理的细胞中，近 90% 获得了健康的基因。
研究人员现在正在寻求批准在 CAR-T 细胞治疗和 IL2RA 缺乏症治疗中使用非病毒 CRISPR 技术推进临床试验。
这个故事最初是由出版 格拉德斯通研究所.
媒体联络：
安迪·默多克，andymurdock@berkeley.edu
朱莉·兰格利尔，julie.langelier@gladstone.org
By
莎拉 CP 威廉姆斯
