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抗 CRISPR 蛋白降低 Cas9 的脱靶效应
抗 CRISPR 蛋白降低 CRISPR-Cas9 的脱靶副作用
伯克利新闻 | 罗伯特·桑德斯 | 12 年 2017 月 XNUMX 日
CRISPR-Cas9 基因编辑 基于策略 菌 开发以保护自己免受 病毒.
现在的研究表明,病毒想出了对策——抑制 蛋白质 被称为抗 CRISPRs——可用于改进 CRISPR-Cas9 作为 基因-治疗工具,减少 不中 可能会导致不必要的副作用的基因编辑。
在一个 本周在杂志上在线报道的研究 科学进展来自加州大学伯克利分校和加州大学旧金山分校的研究人员表明,最近发现的抗 CRISPR 蛋白将脱靶效应降低了四倍之多,就像一个杀死开关,在 CRISPR-Cas9 完成其工作后禁用它。
该研究表明,一种名为 AcrIIA4 的特定抗 CRISPR 蛋白将使用 CRISPR-Cas9 分子的脱靶效应降低了四倍。 向导RNA 找到,剪断并替换 变异的 导致镰刀的血红蛋白基因 细胞 疾病。 它不会显着减少所需的目标基因编辑。
加州大学伯克利分校博士后研究员 Jiyung 说:“意外的突变可能是脱靶基因编辑的结果,但我们的论文——和许多其他论文一样——表明脱靶效应是可以调节的,而且并不像人们想象的那么严重。” Jenny Shin,来自创新学院 Jacob Corn 实验室 基因组学 研究所和论文的三位第一作者之一。
在她对培养的人类细胞进行的实验中,Shin 发现传递 CRISPR-Cas9,然后在几个小时后传递抗 CRISPR 蛋白,是减少脱靶效应的最有效方法。 蛋白质模拟物 的DNA,在 Cas9 上, 酶 这实际上削减了 双链 DNA,并防止进一步切割。
“即使在有效的 CRISPR 六小时后,插入抗 CRISPR 也将脱靶效应降低了两倍以上 目标效应,”申说。 “在治疗上,你可以先用 CRISPR 治疗患者,然后再用抗 CRISPR 治疗,减少脱靶效应。”
发现 AcrIIA4 的研究人员、加州大学旧金山分校的 Joseph Bondy-Denomy 预见这些抗 CRISPR 蛋白将成为 CRISPR 的标准部分 基因治疗,与 CRISPR-Cas9 一起给出,可在固定时间段后禁用基因编辑,以防止随机脱靶切割。
“这种 Cas9 抑制剂可以编码在与 Cas9 相同的 DNA 片段上,例如,在基因编辑完成后精确定时关闭 Cas9,而不是让 Cas9 留在细胞中并冒脱靶效应的风险,”邦迪说-Denomy,他也是该论文的合著者。
抗 CRISPR 结合
该团队包括 Jennifer Doudna 实验室的研究人员,她是 CRISPR-Cas9 基因编辑的发明者之一,他确定了抗 CRISPR 蛋白如何与 CRISPR-Cas9 复合物结合。 使用冷冻电子显微镜,他们发现抗 CRISPR 本质上是模仿 DNA,诱使 CRISPR-Cas9 与其结合,然后再也不放手。
CRISPR 抑制剂靶向 Cas9 蛋白上的一个点,该点对 Cas9 的功能至关重要,当它与抗 CRISPR 结合时,它无法切割 DNA。
去年,Bondy-Denomy 报告发现四种抗 CRISPR 蛋白被用于攻击病毒以灭活细菌中发现的 Cas9 蛋白版本 李斯特菌. 其中两个还抑制了研究人员最常用的 Cas9 蛋白,该蛋白改编自细菌 化脓性链球菌 并被称为 SpyCas9。 另一个团队发现了另外三种抗 CRISPR 蛋白,它们可以对抗一种不同但有前途的 Cas9 蛋白,这些蛋白是从细菌改编而来的 脑膜炎奈瑟菌.
目前的研究着眼于其中一种蛋白质的作用 李斯特菌, AcrIIA4, 在 SpyCas9 上加载了一个指南 RNA 那家在 补充 DNA 结合和切割。
加州大学伯克利分校和其他地方的研究表明,CRISPR-Cas9 不断欺骗细胞的 DNA 修复系统:随着酶在其靶位点切割,细胞修复 DNA,CRISPR-Cas9 再次切割,重复这种恶性循环,直到出现突变在阻止酶结合的 DNA 中,此时 CRISPR-Cas9 分子继续寻找另一个结合位点。
Corn 和 Doudna 实验室目前的工作表明,在 Cas9 成功编辑目标基因后添加抗 CRISPR 可以防止对其他部分的意外损害。 基因组.
“关闭 Cas9 基因编辑的能力与开启它的能力一样重要,”IGI 生物医学科学主任、加州大学伯克利分校分子和细胞生物学助理教授康说。 “想象一下,如果你有一台没有开关的电动剃须刀! 对于最终的治疗应用,能够精确控制基因编辑活动的时间和地点至关重要。 抗 CRISPR 蛋白提供了完全关闭 Cas9 以及微调其活性的机会。”
“Jenny 的数据表明,有一个理想的时间窗口让 Cas9 完成它的工作,然后在这段时间过后将其关闭,”Bondy-Denomy 说。 “我们实际上可以使用抗 CRISPR 蛋白作为工具来确定该时间窗口是什么,也就是说,对于具有任何一种引导 RNA 序列的任何一种细胞类型,我们希望 Cas9 在细胞中活跃多长时间。”
Shin和博士后蒋富国和刘俊杰是该论文的三位第一作者,该论文的共同作者还包括加州大学旧金山分校的 Benjamin Rauch 和博士后 Nicolas Bray、研究员 Seung Hyun Baik 和教授 Eva Nogales,以及 Corn 和IGI 和加州大学伯克利分校分子与细胞生物学系的 Doudna。 Doudna 和 Nogales 是霍华德休斯医学研究所的研究人员。
这项工作得到了 HHMI、李嘉诚基金会、遗产医学研究所和国家老龄化研究所的部分支持。