频繁、快速地检测 COVID-19 对控制疫情蔓延至关重要，尤其是在出现新的、更具传播性的变种时。
虽然今天使用 qRT-PCR（定量逆转录酶聚合酶链反应 (PCR)）的黄金标准 COVID-19 诊断测试非常敏感，可检测到低至一份 RNA 每微升，它需要专门的设备、几个小时的运行时间和一个集中的实验室设施。 因此，测试通常至少需要一到两天的时间。
由加州大学伯克利分校的 Jennifer Doudna、David Savage 和 Patrick Hsu 实验室的科学家领导的一个研究小组旨在开发一种比 qRT-PCR 更快、更容易部署的诊断测试。 它现在结合了两种不同类型的 CRISPR 酶 创建一种可以检测少量 病毒 在不到一个小时的时间内完成 RNA。 Doudna 因发明 CRISPR-而分享了 2020 年诺贝尔化学奖Cas9 基因组编辑.
虽然这项新技术还没有达到可以与 qRT-PCR 的灵敏度相媲美的阶段，qRT-PCR 只能检测到 病毒 每微升液体，它已经能够检测到病毒 RNA 的水平——每微升约 30 个拷贝——足以用于监测人口并限制感染的传播。
“如果检测足够方便和快速，您就不需要 PCR 的敏感性来基本上捕获和诊断社区中的 COVID-19，”共同作者、分子与遗传学教授 David Savage 说。 手机 生物学。 “我们希望尽可能地推动生物化学发展，让您可以想象一种非常方便的格式，在这种环境中，您每天都可以进行测试，例如在上班前进行测试。”
研究人员将于 5 月 XNUMX 日在期刊上在线报告他们的结果 自然 - 化学生物学.
几种基于 CRISPR 的检测已被美国食品和药物管理局授权紧急使用，但都需要一个初始步骤，在该步骤中病毒 RNA 被放大，以便检测信号——包括释放在蓝光下发光的荧光分子——足够亮可以看到。 虽然这种初始扩增将测试的灵敏度提高到与 qRT-PCR 相似的水平，但它也引入了一些步骤，使测试在实验室外更难进行。
加州大学伯克利分校领导的团队寻求在不牺牲检测简单性的情况下达到有用的灵敏度和速度。
除了增加步骤之外，初始扩增的另一个缺点是，因为它会产生数十亿个病毒 RNA 拷贝，所以患者样本交叉污染的可能性更大。 该团队开发的新技术扭转了这一局面，而是增强了荧光信号，消除了交叉污染的主要来源。例如，在你上飞机或去探亲之前，无论是否被感染，”杜德娜实验室的研究科学家、团队负责人 Tina Liu 说。 创新基因组学研究所 (IGI)，一个专注于 CRISPR 的中心，涉及加州大学伯克利分校和加州大学旧金山分校的科学家。
无扩增技术，他们称之为快速集成 核酸酶 串联检测 (FIND-IT) 可以为许多其他传染病提供快速且廉价的诊断测试。
“虽然我们确实为 特快 为了影响 COVID-19，我认为这种特殊技术不仅适用于这种大流行，因为最终 CRISPR 是可编程的，”刘说。 “因此，您可以将针对流感病毒或 HIV 病毒或任何类型的 RNA 病毒的序列加载到 CRISPR 酶中，并且该系统有可能以相同的方式工作。 这篇论文确实证明了这种生物化学是一种更简单的 RNA 检测方法，并且能够在灵敏且快速的时间范围内检测该 RNA，这可能适用于未来在即时诊断中的应用。”
研究人员目前正在使用 FIND-IT 构建此类诊断程序，其中包括收集和处理样本以及在紧凑型微流体设备上运行检测的步骤。
采用串联 Cas 蛋白
为了从方程式中去除目标扩增，该团队采用了一种 CRISPR 酶—— Cas13 — 首先检测病毒 RNA，然后再检测另一类 CAS号 蛋白质，称为 Csm6，以放大荧光信号。
Cas13是用于切割RNA的通用剪刀； 一旦它绑定到它的目标序列，由 a 指定 向导RNA，它准备切割范围广泛的其他 RNA 分子。 这种目标触发的切割活动可用于将特定 RNA 序列的检测与荧光报告分子的释放结合起来。 然而，就其本身而言，当存在极少量的目标 RNA 时，Cas13 可能需要数小时才能产生可检测的信号。
Liu的洞察力是使用Csm6来放大Cas13的效果。 Csm6 是一种 CRISPR 酶，可感知 RNA 小环的存在，并被激活以切割细胞中的各种 RNA 分子。
为了促进 Cas13 检测，她和她的同事设计了一种特殊设计的激活剂分子，当 Cas13 检测到病毒 RNA 时，该激活剂分子会被切割。 该分子的一个片段可以结合并触发 Csm6，从一段 RNA 中切割并释放出明亮的荧光分子。 通常，激活剂分子会被 Csm6 迅速分解，从而限制了它可以产生的荧光信号的数量。 Liu 和她的同事设计了一种化学修饰激活剂的方法，以防止其降解，并且可以为 Csm6 增压以反复切割和释放与 RNA 相关的荧光分子。 这导致灵敏度比原始活化剂好 100 倍。
“当 Cas13 被激活时，它会切割这个小激活剂，去除保护它的片段，”刘说。 “现在它被解放了，它可以激活第二种酶 Csm6 的许多不同分子。 因此，Cas13 识别的一个目标不仅会导致其自身 RNA 切割能力的激活； 它导致产生更多活性酶，然后每个酶都可以 劈开 甚至更多的荧光记者。”
研究人员团队还整合了优化的引导 RNA 组合，使 Cas13 能够更灵敏地识别病毒 RNA。 当它与 Csm6 及其激活剂结合使用时，该团队能够检测到每微升低至 31 个拷贝 SARS-COV-2 RNA 仅需 20 分钟。
研究人员还将从患者样本中提取的 RNA 添加到微流控盒中的 FIND-IT 分析中，以查看该分析是否适用于在便携式设备上运行。 使用带有摄像头的小型设备，他们可以检测从患者样本中提取的 SARS-CoV-2 RNA，其灵敏度可以在峰值时捕获 COVID-19 感染。
“这种串联核酸酶方法——Cas13 加 Csm6——在 37 摄氏度的单一温度下将所有东西组合成一个单一的反应，因此它不需要高温加热或多个步骤，这是其他诊断技术所必需的，”刘说。 “我认为这为更快、更简单的测试开辟了机会，这些测试可以达到与其他当前技术相当的灵敏度，并且有可能在未来达到更高的灵敏度。”
这种用于 RNA 检测的无扩增方法的开发是由于大流行开始解决 COVID-19 诊断和治疗问题时 IGI 内部的研究重新定位。 最终，加州大学伯克利分校的五个实验室和加州大学旧金山分校的两个实验室参与了这个研究项目，这是 IGI 中的众多实验室之一。
“当我们开始这个项目时，我们希望创造出与 PCR 相当但不需要扩增的东西——这将是我们的梦想，”该项目的首席研究员 Savage 说。 “从敏感性的角度来看，我们有大约一万倍的差距。 我们已经成功了大约一千倍； 我们已经将其降低了大约三个数量级。 所以，我们快到了。 去年 XNUMX 月，当我们真正开始制定计划时，这似乎几乎是不可能的。”
这项工作得到了国防高级研究计划局 (N66001-20-2-4033) 的支持。 该论文的合著者包括加州大学伯克利分校的 Jennifer Doudna、David Savage、Patrick Hsu、Liana Lareau 和 Daniel Fletcher 的实验室成员； 澳大利亚莫纳什大学的 Gavin Knott； 格莱斯顿研究所和加州大学旧金山分校的梅兰妮·奥特和凯瑟琳·波拉德； 和 Ming Tan 在 Wainamics 工作，这是一家位于加利福尼亚州普莱森顿的研发公司，生产微流体设备。 Doudna 是 IGI 的创始人，现任 IGI 治理委员会主席和主席，是加州大学伯克利分校的李嘉诚校长，化学和分子和细胞生物学教授。 Hsu、Lareau 和 Fletcher 是生物工程系的教员。
这个故事最初是由 加州大学伯克利分校新闻.
了解更多：
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- 新的基于 CRISPR 的 COVID-19 测试使用智能手机摄像头来发现病毒 RNA （12月2020）
媒体联络： 安迪·默多克，andymurdock@berkeley.edu
