在过去的几个月里,我们在 IGI 的一些人一直在产生新的 核糖核酸 图书馆 CRISPRi 和 CRISPRa. 从近一百个超大 LB-Agar 平板上刮下菌落后,是时候让实验室充满裂解液的甜味了。 菌 和 的DNA 准备缓冲液。 我们使用了 21 个独立的子库,总共约 250,000 个 sgRNA。 质粒 这种规模的准备与我之前所做的任何事情都完全不同,因此我们决定分享一些关于有效准备 sgRNA 文库有效(以及无效!)的想法。
准备工作站
我们担心其他质粒会潜入我们的制备中,尤其是我们实验室中经常使用的单个 sgRNA 质粒。 在开始之前,我们用 70% 乙醇和 RNase-Away 浸泡和擦洗了我们的工作台和真空歧管,并在一天中进行了几次。 这应该有希望破坏或变性任何散落的质粒。 清洁真空阱并在真空管路中放置新的过滤器也是值得的,因为旧的脏过滤器会真正削弱真空能力。
一次性完成所有 DNA 准备工作
对我来说,花几天时间专门用于高通量 DNA 制备比将工作分散在几天内、一次几列上更有效率。
团队合作
大多数质粒制备中的初始裂解和中和步骤都具有时间敏感性,因此一个人一次可以处理的样本数量是有限的。 我们发现一个由 3 人组成的团队(每人一次处理 8 个样本)最大限度地提高了我们的吞吐量,而我们不会相互碰撞。 从柱子上洗脱 DNA 后,一个人可以管理 DNA 沉淀,而其他人则开始下一轮样本。
起始材料
从 23 × 23 cm LB-琼脂平板上刮下菌落,我们得到的平均细菌颗粒质量为 1.1 g(范围 0.5-1.6 g)。 这意味着每盘虫子都有自己的 maxiprep 柱(请参见下面的试剂盒建议)。 如果您正在处理来自液体培养或其他板尺寸的错误,您可以合并或等分样品以获得每列相似的颗粒质量。
质粒制备试剂盒
我们最终尝试了几种不同的质粒制备试剂盒,我们手中的明显赢家是 Sigma GenElute HP Plasmid Maxiprep 试剂盒. 这些色谱柱与我们实验室中已有的 QIAGEN 24 端口真空歧管兼容,该协议适用于批量进行 24 次制备,并且我们建筑物中的室内真空系统足够强大,可以在一次。 重要的是,所有列都运行一致且相当快。 在进行 24 或 4 次制备时,一个缓慢或堵塞的色谱柱是一个令人讨厌但可以解决的问题,但在进行多批次 5 次制备时,它确实可以支持管道。我们从该试剂盒中获得的平均产量为每次制备 24 毫克。
避免使用的工具包:
- Sigma GenElute HP Plasmid Megaprep:Sigma 宣称,与它们的 maxipreps 相比,megaprep 柱的产量是其 4 倍。 我们的一些样本可以合并,因此我们认为将 4 个样本合并到一个大型制备中比将它们作为 4 个单独的最大制备运行更快。 男孩,我们错了! megapreps 必须一次处理一两个,因此根本不能很好地扩展。 最糟糕的是,大型制备柱与 QIAGEN 真空歧管不兼容。 我们设法用管道和适配器解决了这个问题,但室内真空系统的强度只能一次拉动一两个较大的大型制备柱。 对我们来说,大型制备需要更多的时间,而且产量只有我们预期的一半,因为只需研磨 4 倍的 maxipreps。
- QIAGEN Plasmid Plus Maxiprep 试剂盒:我们使用的 1 根柱子中有 8 根柱子在运行澄清的裂解液时停滞。 该柱必须在真空中放置过夜。 我们的产量也低于 Sigma maxipreps。
- QIAGEN HiSpeed Plasmid Maxiprep 试剂盒:这些根本不能很好地扩展。 这些色谱柱与真空歧管不兼容,而且 QIAprecipitator 针头过滤器需要对每个单独的样品进行大量操作。 在前 4 个样本之后,我完全放弃了 QIAprecipitator 步骤。 一次处理 45 或 10 个制备物时,通过 20 分钟的旋转沉淀 DNA 的速度要快得多。
我们总是对如何使下一次 sgRNA 文库制备比上一次更容易感兴趣。 如果您有自己喜欢的质粒制备试剂盒或其他高效文库制备技巧,请随时发表评论。
特别感谢 DNA Prep 团队的其他成员 - Gemma Curie、Amos Liang 和 Emily Lingeman。 如果不是因为他们,我仍然会运行 maxipreps!