发现脱靶效应以实现更安全的基因组编辑
CRISPR-Cas9 系统是基因组编辑领域的革命性突破——但我们如何确保我们的分子剪刀是安全的？ 现在，我们可以搜索 DNA 以找到最后一个切口。
CRISPR-Cas9 基因组编辑 系统削减 的DNA 在科学家指定的确切位置，但有时 Cas9 蛋白质 削减 基因组 在其他地方也会出现这种情况，从而产生“脱靶效应”。 今天发表在期刊上的工作 科学, 创新中心的科学家 基因组学 研究所、格莱斯顿研究所和阿斯利康揭示了一种识别这些不需要的切口的新方法。 当 DNA 断裂或被切割时，DNA 修复蛋白会涌向该部位。 研究人员利用这一现象创建了 DISCOVER-Seq，这是一种使用 DNA 修复蛋白来识别 Cas9 切割位点的方法。
不需要的脱靶效应可能是无害的，但有可能损害 细胞 功能，甚至杀死细胞，具体取决于它们发生的位置。要使用 CRISPR-Cas9 蛋白治疗人类疾病，科学家需要知道脱靶效应是什么，这样他们才能确定治疗是否安全。这是一项艰巨的任务。前 IGI 生物医学主任、现任苏黎世联邦理工学院基因组生物学教授 Jacob Corn 解释说：“找到 CRISPR-Cas 脱靶可能很难。基因组很大，有很多空间需要搜索。当你谈论患者细胞或用于测试潜在基因组编辑疗法的小鼠模型时，事情会变得更加困难。”
当 Cas9 穿过一个 缕 DNA 形成 DNA 断裂，细胞招募 DNA 修复蛋白来修复损伤。 玉米先前已经确定了一些 维修过程中的关键参与者Corn 和共同第一作者 Beeke Wienert 和 Stacia Wyman 想知道是否可以使用修复蛋白来识别 Cas9 和其他 CAS号 编辑会造成 DNA 断裂——尤其是脱靶效应。
研究人员考虑了几种已知的修复蛋白，发现 MRE11 蛋白是最早到达 DNA 断裂位点的蛋白之一。 它像藏宝图上的 X 一样标记该点，告诉其他修复蛋白从哪里开始工作。 使用 CRISPR-Cas9 系统后，研究人员对细胞混合物进行处理，将所有物质冷冻到位，有效地将 MRE11 蛋白粘合到 DNA 上，使其保持附着在 Cas9 切割位点上。 接下来，他们使用抗体寻找 MRE11 蛋白并将其从细胞混合物中分离出来。 最后，他们对粘在 MRE11 蛋白上的 DNA 进行测序，以确定 CRISPR-Cas9 切割位点。 他们称这个过程为 DISCOVER-Seq。
在 CRISPR-Cas9 疗法可用于临床之前，研究人员必须在动物和分离的动物和人类细胞中对其进行广泛测试，以确保其安全有效。虽然还有其他系统可以检测脱靶，通常取决于计算机预测，或在修复后找到切割位点。这些系统通常在特定细胞类型或动物模型中效果最佳，而对于某些细胞类型，没有可靠的方法来找到脱靶。DISCOVER-seq 是第一种可以直接从 CRISPR 任何活组织中的编辑工具。
MRE11 蛋白是关键 DNA 修复途径中最早的参与者之一，存在于哺乳动物细胞系、小鼠和人类中。 这意味着它可以用于以无偏见的方式查找切割站点，并且可以轻松地应用于以前难以使用的不同系统。 “已经有一些非常好的脱靶方法，”Corn 说，“但它们在高度受控的系统中效果最好，比如在实验室培养皿中培养细胞。 DISCOVER-Seq 的一个优势是它理论上可以在 任何 基因组编辑工作的系统。”
由于 MRE11 允许研究人员在切割完成后立即放大切割部位，因此研究人员还发现了有关 DNA 修复如何工作的新事物。 他们最终可能会利用这些知识来改进 CRISPR-Cas9 基因组编辑。
为了尽快将这项新技术提供给其他研究人员，Corn 和他的同事通过开放获取存储库将论文的早期版本放到了网上 bioRxiv，并使他们的 协议 和 生物信息学工具 也可以公开获得。 “DISCOVER-Seq 在实验室中已经很有用，”Corn 说，“我们希望有一天它可以用于在基因组编辑治疗过程中发现脱靶。”
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这项研究发表在该杂志的网络版上 科学 作为“使用 DISCOVER-Seq 在体内无偏检测 CRISPR 脱靶。” 除了 Corn、Wienert 和 Wyman，其他作者还有 Christopher D. Richardson、Charles D. Yeh、Pinar Akcakaya、Michelle J. Porritt、Michaela Morlock、Jonathan T. Vu、Katelynn R. Kazane、Hannah L. Watry、Luke M. Judge、Bruce R. Conklin 和 Marcello Maresca。 该研究由李嘉诚基金会、传统医学研究所、国家心肺血液研究所、格拉德斯通研究所、范可尼贫血研究基金会、加州再生医学研究所、美国澳大利亚协会和澳大利亚国家健康和医学研究委员会。
创新基因组学研究所 (IGI) 是加州大学伯克利分校和加州大学旧金山分校之间的一个非营利性学术合作机构，支持整个湾区的合作研究项目。 IGI 的使命是开发和部署基因组工程，以治愈疾病、确保粮食安全并为今世后代维持环境。 作为基因组编辑、功能基因组学和其他尖端技术的先驱，IGI 科学家不断突破科学的界限。
媒体联系
梅根 Hochstrasser：megan.hochstrasser@berkeley.edu
雅各布·玉米：jacob.corn@biol.ethz.ch
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精选媒体报道:
DISCOVER-Seq：一种检测 CRISPR 脱靶的新工具
综合博客 | Meenakshi Prabhune | 19 年 2019 月 XNUMX 日
新闻注意点——检测 CRISPR 的脱靶效应； 防止肥胖的基因变异
激烈的生物技术 | 阿琳·温特劳布 | 22 年 2019 月 XNUMX 日
By
希望亨德森
