高度针对性的 CRISPR 传递推进了活体动物的基因编辑

信封递送工具利用病毒的技巧潜入细胞

最受认可 基因疗法 今天，包括那些涉及 CRISPR-Cas9，发挥他们的魔力 细胞 从体内取出，然后将编辑后的细胞送回患者体内。

该技术非常适合靶向血细胞，目前是新批准的 CRISPR 所采用的方法 基因 用于治疗镰状细胞性贫血等血液疾病的疗法，在患者的骨髓被化疗破坏后，将经过编辑的血细胞重新注入患者体内。

一种新的、精确靶向的 CRISPR-Cas9 递送方法， 11 月 XNUMX 日发布 在杂志 自然·生物技术“，启用 基因编辑 对仍在体内的非常特定的细胞子集进行研究——这是朝着可编程输送方法迈出的一步，该方法将消除在给予患者编辑后的血细胞之前消除患者的骨髓和免疫系统的需要。

该递送方法由 CRISPR-Cas9 联合发明人 Jennifer Doudna 的加州大学伯克利分校实验室开发 基因组 编辑，涉及包装 Cas9 编辑 蛋白质 和 指导RNA 在一个膜泡中，膜泡上装饰有单克隆抗体碎片，这些单克隆抗体可以锁定特定类型的血细胞。

作为演示，创新中心 Doudna 实验室的 CRISPR 研究员 Jennifer Hamilton 基因组学 研究所 (IGI)，针对免疫系统的细胞——T 细胞——这是革命性的起点 癌症 治疗称为嵌合抗原受体（CAR）T 细胞疗法。 Hamilton 和她的同事对配备了人源化免疫系统的活小鼠进行了治疗，并将它们的人类 T 细胞转化为 CAR T 细胞，能够瞄准并消除另一类免疫细胞（B 细胞）。

汉密尔顿说，这一壮举是一个原理证明，显示了使用这种载体方法（包膜运输工具）来瞄准和编辑活体动物中的血细胞和潜在其他类型的细胞的潜力。体内），最终是人类。

汉密尔顿说：“我们的方法涉及多重靶向分子，也就是说，我们的粒子上有两个或多个靶向分子，它们与目标细胞相互作用，有点像计算机中的与门。”他指的是仅在两个事件发生时才运行的逻辑电路同时地。 “当颗粒利用两种抗体配体相互作用结合时，我们能够获得更有效的递送。在用 T 细胞靶向载体治疗小鼠后，我们在我们感兴趣的细胞类型 T 细胞中观察到基因组工程，而不是在肝细胞中。”

她说，对于所有将基因传递到细胞中的方法来说，高度特异性的靶向都是困难的。尤其是肝细胞，通常会占用定向到其他地方的运载工具。

病毒包膜

汉密尔顿和她的团队正在研究提供基因疗法的几种实验技术之一。许多采用封装的外层 病毒 — 病毒被清空并填充校正剂 转基因 或基因编辑工具，如 CRISPR-Cas9。其他方法，包括 IGI 研究人员正在探索的一种方法，依赖于直接将细胞穿透性 Cas9 蛋白注射到小鼠体内来实现基因组编辑。

汉密尔顿在攻读博士学位时研究了流感等包膜病毒，她专注于改造这类病毒，因为它们有更灵活的外层，由它们出芽的细胞的外膜组成。

在 2021 年的出版物中，她证明了 HIV-1 的外膜 病毒，它被掏空并充满 Cas9，她称之为病毒样颗粒（VLP），可以编辑培养物中的 T 细胞（体外）并将它们转化为 CAR T 细胞。从那时起，她对病毒包膜进行了如此大的改变，以至于她现在将它们称为包膜运输工具（Envelopeed Delivery Vehicle，EDV）。

EDV的一个关键方面是其外膜可以很容易地用多个抗体片段或靶向配体装饰，这大大提高了靶向特异性。其他基因传递载体，例如腺相关病毒和 脂质纳米颗粒，事实证明更难精确定位。

汉密尔顿说：“人们正在努力重新定位所有这些载体，使其对一种细胞类型具有特异性，并使它们不再靶向传递到其他细胞类型。” “你可以展示抗体或抗体片段，就像我们一直在做的那样，但旁观者细胞的吸收仍然相当高。您可以将递送偏向一种细胞类型，但您仍然可以观察到旁观者细胞的摄取。在我们的论文中，我们实际上检查了肝脏，看看我们是否得到了 不中 交货并没有看到。我认为用更传统的非信封方式来实现这一点会更具挑战性 病毒载体 或脂质纳米颗粒。”

在论文中，汉密尔顿和她的同事试图复制 体内 an 体外 CRISPR CAR T 细胞疗法成功用于癌症患者 报道 in 科学 2020 年。该疗法不仅为靶向癌细胞的受体提供了转基因，还使用 ​​CRISPR 敲除了不靶向癌症的受体。

加州大学伯克利分校的研究人员成功敲除天然 T 细胞受体，并为靶向 B 细胞（癌细胞的代表）的受体提供转基因。由于 Cas9 蛋白与转基因一起在同一 EDV 内传递，因此它的寿命比传递 Cas9 基因的方法更短，这意味着脱靶编辑更少。

汉密尔顿说：“我们在这篇论文中试图实现的目标是跳过在体外设计细胞的整个步骤。我们的目标是系统地施用单一载体，该载体可以在体内特定细胞类型中进行基因递送和基因敲除。我们使用这种递送策略来制造基因编辑的 CAR T 细胞 体内，希望我们能够简化用于制造基因编辑 CAR T 细胞的复杂流程 体外设立的区域办事处外，我们在美国也开设了办事处，以便我们为当地客户提供更多的支持。“

Doudna 和她的实验室继续提高 EDV 介导的传递效率。汉密尔顿曾是杜德纳实验室的博士后研究员，作为 IGI 的研究员，正在进一步开发这种递送方法。 女性参与科学进取计划。实验室关注有效载体的最终原因 体内 是让 CRISPR 疗法更广泛、更便宜。在最近的一次 文章 在《连线》杂志上，杜德纳提到了当今昂贵的基因疗法的不公平性，部分原因是患者接受骨髓移植时需要延长住院时间。

“镰状细胞病的治疗预计每位患者的费用将超过 2 万美元，而美国只有少数机构具备提供这种治疗的技术能力，”杜德娜 (Doudna) 因她的同事分享了 2020 年诺贝尔化学奖而写道。 - CRISPR-Cas9基因组编辑的发明。 “新技术允许 体内 提供基因编辑疗法和改进制造将是压低价格的关键，大学、政府和行业之间以负担得起为共同目标的独特伙伴关系也是如此。仅仅制造工具是不够的。我们必须确保它们到达最需要它们的人手中。”

除了 Hamilton 和 Doudna 之外，该论文的其他合著者还有 Evelyn Chen、Barbara Perez、Cindy Sandoval Espinoza、Min Hyung Kang 和 Marena Trinidad（均隶属于 IGI 和加州大学伯克利分校分子和细胞生物学系）以及 Wayne Ngo旧金山格拉德斯通研究所。

• 使用包膜递送载体进行体内人类 T 细胞工程 (自然·生物技术“)
• CRISPR-Cas9 和转基因的靶向递送使复杂的免疫细胞工程成为可能 (细胞的报告，2021）
• 你如何进入细胞内部？ 复制病毒 (2021)

第一章原文发表 伯克利新闻. 

By 罗伯特·桑德斯

罗伯特·桑德斯 (Robert Sanders) 是加州大学伯克利分校 (UC Berkeley) 的科学传播经理，撰写的领域涵盖从生物技术和恐龙到大脑研究和全球气候变化等领域。 他还是加州大学毕业 (MS Physics '76)，曾在加州大学伯克利分校新闻学院学习科学写作技巧。