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Herramientas y reactivos

Para ayudar a que la ingeniería del genoma CRISPR sea accesible para otros investigadores, compartimos nuestros protocolos y reactivos siempre que sea posible. También mantenemos una lista de herramientas computacionales que pueden ser útiles para configurar experimentos CRISPR, analizar datos y más.

Protocolos

Echa un vistazo a nuestro JoVE detallado protocolo y video guía adjunto para la edición del genoma con CRISPR-Cas9 RNP en células T y HSPC humanas primarias, Caenorhabditis eleganse invirtiendo Parhyale hawaiensis.
Los protocolos adicionales para una variedad de técnicas relacionadas con la edición de genes CRISPR-Cas9 están disponibles de forma gratuita en protocolos.io. Explore los protocolos generados por IGIque incluyen:

  • Expresión y purificación de la proteína Cas9
  • In vitro transcripción de ARN guía
  • Nucleofección Cas9 RNP
  • Extracción de ADN genómico y PCR
  • Re-amplificación de bibliotecas CRISPRi y CRISPRa

 

Protocolos utilizados por nuestro Instalación de cribado CRISPR puede ser encontrado aquíque incluyen:

  • Clonación, secuenciación y reamplificación de bibliotecas de gRNA
  • Generando líneas celulares estables que expresan Cas9
  • Producción y transfección de lentivirus a gran escala
  • Detección de células adherentes y en suspensión

 

También hay disponibles colecciones más grandes de protocolos:

CRISPR-Cas: un manual de laboratorio. Editado por Doudna JA y Mali P. Prensa de laboratorio Cold Spring Harbor (2016).
Contiene una variedad de protocolos para la manipulación del genoma con Cas9, incluida la edición del genoma, la resolución de problemas en organismos específicos, cómo detectar la edición, guiar la construcción de la biblioteca de ARN y la detección de inhibición o activación de CRISPR.

Métodos y protocolos CRISPR. Editado por Lundgren M, Charpentier E y Fineran PC. Métodos en biología molecular (2015).
Presenta protocolos para estudiar los mecanismos de inmunidad CRISPR-Cas desde perspectivas genéticas, genómicas, moleculares, bioquímicas y estructurales.

Edición del genoma en animales. Editado por Hatada I. Métodos en biología molecular (2017).
Abarca métodos para editar genomas de muchos animales diferentes, incluidos insectos, peces y mamíferos.

Plásmidos y Bibliotecas

Una variedad de plásmidos y bibliotecas de ARN guía agrupadas para la manipulación del genoma mediada por CRISPR generada por los laboratorios miembros de IGI y otros se pueden adquirir a través de Addgene. Nuestro Instalación de cribado CRISPR también distribuye ciertas bibliotecas de gRNA.

Líneas celulares

Las líneas celulares de interferencia, activación o desactivación de CRISPR publicadas se pueden proporcionar a pedido de la instalación de cultivo celular en UC Berkeley. Examinar las líneas disponibles aquí y comuníquese con Alison Killilea para obtener más información: ankillilea (at) berkeley.edu.

Diseño de ARN guía

* Es posible que desee utilizar una herramienta diseñada específicamente para el organismo que desea editar. *

Tutorial "Cómo hacer un ARN guía para un Knockout Cas9" (IGI)

CHOPCHOP (Universidad de Bergen y Facultad de Medicina de Harvard)

Suite CRISPR RGEN (Instituto de Ciencias Básicas, Corea; Universidad Nacional de Seúl; Universidad Hanyang)
Contiene herramientas para identificar posibles sitios fuera del objetivo (Cas-OFFinder) y regiones de microhomología (Microhomology-Predictor), así como una herramienta de diseño de ARN guía que incorpora estos parámetros (Cas-Designer).

E-CRISP (DKFZ)

Diseñador sgRNA (CRISPRko & CRISPRa / i) (Amplio)
Ambas herramientas funcionan para S. pyogenes y los S. aureus Cas9 (respectivos PAM: NGG y los NNGRR); usar Puntuación de determinación de frecuencia de corte (CFD) de Doench para evaluar fuera de objetivos.

CRISPOR (Tefor)
Diseñe gRNA y cebadores adjuntos para la clonación, expresión y validación de ediciones genómicas de gRNA. Muestra múltiples puntuaciones de especificidad, incluidas Doench y los Moreno-Mateos.

CRISPR-P (Universidad Agrícola de Huazhong)
Diseñar ARNg para la edición del genoma en plantas. Elija entre los PAM correspondientes a múltiples variantes y ortólogos Cas9 / Cas12.

PrimeDesign (Harvard / MGH / Broad)
Diseñe ARN guía de edición principal (pegRNA) y sgRNA de corte (ngRNA) para experimentos de edición principal. También contiene PrimeVar, una base de datos de pares candidatos de pegRNA / ngRNA para corregir miles de mutaciones humanas patógenas diferentes.

Diseño de pantalla CRISPR de alto rendimiento

cld (diseñador de biblioteca CRISPR) (Instituto de Ontario para la Investigación del Cáncer)
Diseñar bibliotecas de sgRNA multiespecies.

Lote CRISPOR (Tefor)
Diseñe gRNA para pantallas de eliminación de genes lentivirales en células humanas o de ratón.

Scripts CRISPRiaDesign (UCSF)
Ofrece scripts básicos de aprendizaje automático de sgRNA que se utilizan para generar bibliotecas CRISPRi y CRISPRa de próxima generación a partir del laboratorio de Jonathan Weissman.

Introducción a la producción de líneas celulares CRISPRi / a (UCSF)
La práctica guía del laboratorio Weissman sobre cómo generar y validar líneas celulares CRISPRi y CRISPRa de expresión estable.

Análisis de datos de secuenciación

Datos de secuenciación de Sanger agrupados

MAREA Y TIDER (Desktop Genetics; Instituto del Cáncer de los Países Bajos)
Analice las trazas de secuenciación de Sanger de grupos de células para cuantificar el espectro indel alrededor del sitio de corte (TIDE) o mutaciones en plantilla (TIDER).

 

Datos NGS

CasAnalyzer (Instituto de Ciencias Básicas, Corea; Universidad Nacional de Seúl; Universidad Hanyang)
Ofrece una evaluación instantánea basada en JavaScript de la edición de datos NGS del genoma.

CRISPResso (Mass General Hospital y Harvard)
Analice datos de secuenciación profunda para determinar los resultados después de editar genomas con Cas9, Cas12, editores de base, editores principales, etc.

 

Datos de pantalla CRISPR

CARPINAS (Instituto de Ontario para la Investigación del Cáncer)
Analice datos NGS sin procesar de pantallas CRISPR agrupadas.

MAGeCK (Análisis basado en modelos de Knockout CRISPR / Cas9 en todo el genoma) (Dana-Farber y Harvard)
Analice los datos de las pantallas knockout CRISPR de todo el genoma.

Procesamiento de pantalla (UCSF)
Analice los datos de secuenciación de las pantallas CRISPR agrupadas.

CRISPRAnalyzeR (DKFZ)
Conjunto de análisis basado en web y fácil de usar para pantallas CRISPR-Cas9 agrupadas.

Bases de datos y otras herramientas

CRISPRCasdb, CRISPRCasFinder, y otros CRISPR-Cas ++ herramientas (Universidad de Paris-Saclay)
Encuentra cas genes matrices CRISPR en una especie procariota de interés de una base de datos de genomas analizados (db) o en una secuencia cargada por el usuario (Finder).

Lista de Anti-CRISPR de Bondy-Denomy Lab (UCSF)
Esta hoja incluye todos los anti-CRISPR publicados, incluido su nombre, secuencia de aminoácidos, los sistemas CRISPR que inhiben y otros detalles.

Genoma CRISPR (DKFZ)
Esta base de datos recopila los resultados de los estudios de cribado de alto rendimiento CRISPR-Cas9, con datos de más de medio millón de ARN guía en 421 líneas celulares humanas.

ClinVar (NIH)
Una base de datos con capacidad de búsqueda de variantes genómicas humanas y consecuencias conocidas para la salud.

ClinicalTrials.gov (NIH)
Una base de datos de búsqueda de estudios clínicos realizados en todo el mundo. Por ejemplo, ingrese "CRISPR" en el campo "Otros términos" y luego haga clic en "Buscar" para ver todos los ensayos clínicos actuales que involucran tecnologías CRISPR.

Lista de recursos CRISPR de Addgene