Ilustración de una partícula similar a un virus que brota de una membrana celular.
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La entrega CRISPR altamente dirigida avanza en la edición de genes en animales vivos

By Roberto Sanders

Los vehículos de reparto de sobres utilizan trucos de virus para colarse en las células

Más aprobados gen Las terapias actuales, incluidas aquellas que involucran CRISPR-Cas9, hacen su magia en células extraídas del cuerpo, después de lo cual las células editadas se devuelven al paciente.

Esta técnica es ideal para apuntar a las células sanguíneas y actualmente es el método empleado en los tratamientos recientemente aprobados. edición del Terapias genéticas para enfermedades de la sangre como la anemia falciforme (SCD por sus siglas en inglés), anemia, en la que se reinfunden células sanguíneas editadas en pacientes cuya médula ósea ha sido destruida por la quimioterapia.

Un nuevo método de administración de precisión para CRISPR-Cas9, publicado en enero de 11 en la revista Nature Biotechnology, permite la edición genética en subconjuntos muy específicos de células mientras aún están en el cuerpo, un paso hacia un método de administración programable que eliminaría la necesidad de destruir la médula ósea y el sistema inmunológico de los pacientes antes de administrarles células sanguíneas editadas.

El método de entrega, desarrollado en la Universidad de California, Berkeley, laboratorio de Jennifer Doudna, coinventora de CRISPR-Cas9 edición del genoma, implica envolver el Cas9 editando proteínas y guíando ARN en una burbuja de membrana que ha sido decorada con trozos de anticuerpos monoclonales que se dirigen a tipos específicos de células sanguíneas.

Como demostración, Jennifer Hamilton, investigadora de CRISPR en el laboratorio Doudna del Innovative Genómica Institute (IGI), se centró en una célula del sistema inmunológico, una célula T, que es el punto de partida de un revolucionario células cancerosas tratamiento llamado terapia de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR). Hamilton y sus colegas trataron ratones vivos que habían sido equipados con un sistema inmunológico humanizado y convirtieron sus células T humanas en células T CAR capaces de localizar y eliminar otra clase de célula inmune, una célula B.

La hazaña fue una prueba de principio, dijo Hamilton, que muestra el potencial de utilizar este método de transporte (vehículos de entrega envueltos) para apuntar y editar células sanguíneas y potencialmente otros tipos de células en animales vivos (in vivo) y, eventualmente, los humanos.

“Nuestro enfoque implica la multiplexación de moléculas de destino, es decir, tener dos o más moléculas de destino en nuestras partículas que interactúan con su célula objetivo de manera similar a una puerta AND en una computadora”, dijo Hamilton, refiriéndose a los circuitos lógicos que funcionan solo cuando ocurren dos eventos simultáneamente. “Pudimos obtener una administración más efectiva cuando las partículas se unieron utilizando dos interacciones de ligando de anticuerpo. Después de tratar ratones con vectores dirigidos a células T, observamos genoma, “Ingeniería en nuestro tipo de células de interés, las células T, y no en los hepatocitos del hígado”.

La focalización altamente específica es difícil para todos los métodos de introducción de genes en las células, dijo. Las células del hígado, en particular, a menudo utilizan vehículos de transporte dirigidos a otros lugares.

Sobres virales

Hamilton y su equipo están investigando una de las diversas técnicas experimentales para administrar terapias genéticas. Muchas emplean la capa externa de virus encapsulados: los virus se vacían y se rellenan con transgenes correctivos o herramientas de edición genética como CRISPR-Cas9. Otros métodos, incluido uno que están explorando los investigadores del IGI, se basan en inyectar directamente proteínas Cas9 que penetran en las células en ratones para lograr la edición del genoma.

 

gráfico que compara la administración viral, no viral y de VED
Las estrategias tradicionales para introducir herramientas de edición de genes en las células requieren codificar y expresar viralmente las herramientas CRISPR-Cas (izquierda) o insertar directamente el ARN mensajero que codifica Cas9 o la ribonucleoproteína Cas9 (RNP) preformada en las células diana (centro). El método viral tiene la ventaja de que las proteínas en el exterior de la partícula se unen de manera muy eficiente al exterior de las células para entregar herramientas CRISPR codificadas viralmente. Este último método garantiza una vida corta para la maquinaria de edición de Cas9, de modo que no comience a cortar genes distintos del gen objetivo. Jennifer Hamilton y sus colegas del IGI utilizaron un enfoque diferente: empaquetar RNP Cas9 y un transgén dentro de una partícula envuelta (derecha).

 

Hamilton, que estudió virus con envoltura como la influenza para su doctorado, se centró en diseñar esa clase de virus porque tienen una capa exterior más flexible, que consiste en la membrana exterior de la célula de la que brotaron.

En una publicación de 2021, demostró que la envoltura exterior de una vacuna VIH-1 virus, que había sido destripado y llenado con Cas9 y que ella llamó partícula similar a un virus (VLP), podía editar células T en cultivo (ex vivo) y convertirlas en células CAR T. Desde entonces, ha alterado tanto la envoltura viral que ahora se refiere a ellos como vehículos de entrega envueltos o EDV.

Un aspecto clave de los EDV es que sus envolturas externas se pueden decorar fácilmente con más de un fragmento de anticuerpo o ligando de destino, lo que mejora enormemente la especificidad de destino. Otros vehículos de administración de genes, como los virus adenoasociados y las nanopartículas lipídicas, han demostrado ser más difíciles de dirigir con precisión.

“Hay esfuerzos para reorientar todos estos vectores para que tengan especificidad hacia un tipo de célula y desorientarlos para que no se distribuyan a otros tipos de células”, dijo Hamilton. “Puedes mostrar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, como lo que hemos estado haciendo, pero la captación en las células espectadoras sigue siendo bastante alta. Puedes sesgar la administración hacia un tipo de célula, pero aún puedes observar la captación en las células espectadoras. En nuestro artículo, en realidad analizamos el hígado para ver si estábamos obteniendo una administración fuera del objetivo y no vimos nada. Creo que sería más difícil lograr eso con un método sin envoltura más tradicional. vector viral or nanopartícula lipídica."

En el artículo, Hamilton y sus colegas intentaron replicar in vivo an ex vivo La terapia de células T CRISPR CAR administrada con éxito a pacientes con cáncer que fue reportaron in Ciencias: en 2020. Esa terapia no solo proporcionó un transgén para un receptor dirigido a las células cancerosas, pero eliminado, mediante CRISPR, los receptores que no se dirigen al cáncer.

Los investigadores de la Universidad de California en Berkeley lograron eliminar el receptor de células T nativo y administrar un transgén para un receptor que apuntaba a las células B, un sustituto de las células cancerosas. Debido a que la proteína Cas9 proteína se administró junto con el transgén dentro del mismo EDV, tuvo una vida útil más corta que los métodos que administran un gen Cas9, lo que se traduce en menos ediciones fuera del objetivo.

“Lo que hemos tratado de lograr en este artículo”, dijo Hamilton, “es saltarnos todo el paso de tener que diseñar células fuera del cuerpo. Nuestro objetivo era administrar sistémicamente un único vector que realizara tanto la entrega de genes como la eliminación de genes en tipos de células específicas dentro del cuerpo. Utilizamos esta estrategia de administración para producir células T con CAR editadas genéticamente in vivo, con la esperanza de poder agilizar el complejo proceso utilizado para fabricar células T CAR editadas genéticamente ex vivo."

dos manchas naranjas, una es un sistema de administración dirigida y la otra una célula
Una representación artística de una ribonucleoproteína Cas9 encapsulada en un vehículo de administración envuelto (izquierda) decorado con fragmentos de anticuerpos que se alojan en un tipo específico de célula (derecha). Dentro de la célula, el ADN destinado a ser editado por Cas9 se muestra en gris. Ilustración del coautor Connor Tsuchida.

Doudna y su laboratorio continúan mejorando la eficiencia de la administración mediada por EDV. Hamilton, ex investigador postdoctoral en el laboratorio de Doudna, está desarrollando aún más este método de administración como miembro del IGI. Programa Mujeres en la Ciencia Emprendedora. La razón principal del laboratorio para centrarse en vectores que funcionan in vivo es hacer que las terapias CRISPR estén más ampliamente disponibles y sean más baratas. En una reciente ensayo En la revista Wired, Doudna se refirió a las desigualdades de las costosas terapias genéticas actuales, en parte debido a las largas estancias hospitalarias que se requieren cuando un paciente se somete a un trasplante de médula ósea.

"Se prevé que la terapia para la anemia de células falciformes cueste más de 2 millones de dólares por paciente, y sólo un pequeño número de instalaciones en Estados Unidos tienen la capacidad tecnológica para proporcionarla", escribió Doudna, que compartió el Premio Nobel de Química 2020 por su colaboración. -invención de la edición del genoma CRISPR-Cas9. “Nuevas tecnologías que permiten in vivo La entrega de terapias de edición genética y la mejora de la fabricación serán clave para reducir los precios, al igual que las alianzas únicas entre universidades, el gobierno y la industria, unidas con la asequibilidad como objetivo común. No basta simplemente con fabricar las herramientas. Debemos asegurarnos de que lleguen a quienes más los necesitan”.

Además de Hamilton y Doudna, otros coautores del artículo son Evelyn Chen, Barbara Perez, Cindy Sandoval Espinoza, Min Hyung Kang y Marena Trinidad, todos afiliados al IGI y al Departamento de Biología Celular y Molecular de UC Berkeley, y Wayne Ngo. de los Institutos Gladstone de San Francisco.


La financiación fue proporcionada por los Institutos Nacionales de Salud (RM1HG009490, U01AI142817-02, U19 64542, 64340), el Departamento de Energía de EE. UU. (63645), Emerson Collective y el Instituto Médico Howard Hughes. Hamilton contó con el apoyo del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (K99GM143461-01A1) y el Fondo en Memoria de Jane Coffin Childs para la Investigación Médica.

Contacto con los medios

Andy Murdock, andymurdock@berkeley.edu

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Artículo publicado originalmente por Noticias de Berkeley

Foto de cabeza de Robert Sanders, un hombre caucásico de mediana edad By Roberto Sanders

Robert Sanders es gerente de comunicaciones científicas en UC Berkeley y escribe sobre campos que van desde la biotecnología y los dinosaurios hasta la investigación del cerebro y el cambio climático global. También es un graduado de Cal (MS física '76) que aprendió el oficio de la escritura científica en la Escuela de Periodismo de UC Berkeley.