Siguiendo mi publicación anterior sobre bibliotecas CRISPR de genoma completo, Pensé que sería útil mostrar un poco más.
Hay muchas cosas a tener en cuenta al realizar el trabajo de biblioteca, pero dos de las principales son
- ¿Qué tan seguro está de que un éxito proviene de la actividad en el objetivo vs. fuera del objetivo ¿astucia?
- ¿Qué fracción de la biblioteca es funcional?
El objetivo de encendido y apagado es la verdadera preocupación, ya que podría pasar una gran cantidad de tiempo persiguiendo golpes falsos. CRISPR (y sh / siRNA) abordan este problema con redundancia, y siempre se debe requerir que un fenotipo enriquezca múltiples guías correspondientes al mismo gen. Pero en bibliotecas con una redundancia relativamente baja (por ejemplo, GeCKOv1 solo tiene 3-4 guías por gen), es fácil enamorarse de un éxito con un fenotipo candente pero solo una guía.
La preocupación por la fracción funcional de la biblioteca es más técnica, pero afecta tanto la facilidad de la pantalla como el punto de redundancia desde arriba. Si muchas de sus guías no son funcionales, todo ese trabajo extra para clonar y transducir su biblioteca masiva frente a una más pequeña es un esfuerzo inútil. Peor aún, sus posibilidades de redundancia se reducen con cada guía no funcional.
Con eso en mente, aquí están las distribuciones actualizadas para los genoma,-Bibliotecas de guías amplias dirigidas a humanos células. El eje de "penalización" está en escala logarítmica y las penalizaciones son fácilmente interpretables para resaltar la clase del problema. Para las penalizaciones, el lugar de las decenas representa la puntuación de un guía en sí, el lugar de los 100 representa el número de objetivos fuera de objetivos intergénicos y el lugar de los 1000 representa los objetivos genéticos.
Por ejemplo, cualquier cosa con log (penalización) = 0-2 no tiene objetivos fuera de objetivo y podría estar bien, aunque los guías tienen muchas más posibilidades de no funcionar completamente cuando uno se acerca a 2. log (penalización) = 2-3 tienen intergénicos fuera del objetivo, con cada punta de 100 un impacto adicional fuera del objetivo (por ejemplo, penalización de 100 = uno fuera del objetivo, 200 = dos fuera del objetivo, etc.). log (penalización) = 3-4 contienen secuencias terminadoras Pol III y probablemente nunca sean iguales transcritas. log (penalización) = 4 + tener genico fuera del objetivo, con cada pico de 100 un objetivo adicional que incide en un gen (por ejemplo, penalización de 1000 = uno fuera del objetivo, 2000 = dos fuera del objetivo). Estas penalizaciones se combinan, por lo que una puntuación de 2,354 significa dos objetivos fuera de objetivo genicos, 3 objetivos fuera de objetivo intergénicos y una penalización de guía de 54.
Tenga en cuenta que llamar a genic vs intergenic se realiza usando Datos de conjunto y es sensible al tipo de experimento CRISPR. CRISPRi busca aciertos dentro de -50 a +300 de un gen, mientras que CRISPRcutting mira los exones (por el momento dejaremos de lado la aterradora perspectiva de cortar dentro de regiones intrónicas o UTR potencialmente funcionales).
En general, las cosas se ven bastante bien para CRISPRi. Aquí hay una pequeña ventaja, ya que CRISPRi solo parece funcionar en una ventana estrecha alrededor del sitio de inicio de la transcripción, por lo que es menos probable que los objetivos fuera de los objetivos golpeen un gen. Las bibliotecas CRISPRcutting no funcionan tan bien con los objetivos fuera de los exones anotados, y solo un análisis más profundo por guía diría si la redundancia de la guía se ocupa de los fenotipos mal llamados. Es bueno ver que GeCKO ha mejorado con v2 (por ejemplo, se ha deshecho de las secuencias de terminación), y es de esperar que v3 pueda controlar algunos de los objetivos genicos fuera de lugar.
Quiero enfatizar que todas estas bibliotecas funcionan bien y se han utilizado con éxito para brindar información biológica. Pero tenga en cuenta estas propiedades de la guía cuando trabaje con cada biblioteca y piense en los resultados que surgen de su uso.
