Knockout mejorado con Cas9

Cas9 suele ser bastante bueno en gen knockear. Excepto cuando no lo es. La mayoría de las personas que se han mojado los pies con edición de genes He tenido una experiencia así en el siguiente gel, en la que algunos guías funcionan muy bien pero otros son perros absolutos.

Eso es un problema si tiene restricciones de orientación (p. Ej. al ir tras un dominio funcional en lugar de simplemente hacer un corte colocado al azar). Entonces, ¿qué se puede hacer al respecto?

TL; DR La adición de ADN monocatenario no homólogo cuando se usa Cas9 RNP aumenta en gran medida la eliminación del gen.

El problema

Ha habido unos pocos muy agradable artículos que muestran que Cas9 prefiere ciertas guías. Me refiero a estos como la hipótesis de One True Guide, con la idea de que Cas9 de alguna manera ha evolucionado para gustar de algunos protoespaciadores y no gustar de otros. Los datos no mienten, y de hecho hay verdad en esto: a Cas9 le gusta una G cerca del PAM y odia usar C. Pero guías que son muy activos en una línea celular son pobres en otrasy comparando experimentos de preferencia en ratones células vs gusanos da respuestas muy diferentes. Eso no es lo que esperaría si el problema radica únicamente en la capacidad de Cas9 para usar un un ARN guía hacer un corte.

Pero, por supuesto, Cas9 solo está haciendo recortes. Todo lo demás se reduce a ADN reparación por la célula huésped.

nuestra solución

En un nuevo artículo de mi laboratorio, acaba de salir en Nature Communications, descubrimos que usar un truco simple para alterar la reparación del ADN puede rescatar guías totalmente inactivas y facilitar el aislamiento de clones knockout, incluso en contextos desafiantes (por ejemplo, poliploides). A este enfoque lo llamamos "NOE", para mejora de oligonucleótidos no homólogos.
(El acrónimo es en realidad una broma privada para mí, ya que solía trabajar con NOE en un contexto muy diferentey valle de noe es un bonito vecindario en San Francisco)

¿Cómo se realiza la NOE? En realidad, es super simple. Al usar Cas9 RNP Para editar, simplemente agregue ADN monocatenario no homólogo a su reacción de electroporación. Eso es todo. Esto aumenta indel frecuencias varias veces en una amplia variedad de líneas celulares y hace que sea fácil encontrar knockouts homocigotos incluso cuando se utilizan guías que normalmente funcionan mal.

La clave de la NOE es tener extremos de ADN adicionales. El ADN monocatenario funciona mejor, e incluso los ADNss homólogos que se pueden usar para HDR, por sus siglas en inglés trabaja. Tendemos a utilizar ssDNA que no son homólogos al humano. genoma, (por ejemplo, un poco de secuencia de BFP) porque simplifican mucho la edición de los resultados (NHEJ, por sus siglas en inglés solo en lugar de NHEJ + HDR). Pero los ADN de doble hebra también funcionan, ¡e incluso el ADN de esperma de salmón cortado funciona! Plásmidos no son buenos, ya que no hay extremos libres.

Sabemos que NOE está haciendo algo para reparar el ADN, porque si bien esto funciona en muchas líneas celulares, ¡los resultados moleculares difieren entre las células! En muchas celdas (5/7 que hemos probado), NOE provoca la aparición de deleciones muy grandes (mucho más grandes de lo que normalmente vería al usar Cas9). ¡Pero en 2/7 células probadas, NOE hizo que las células comenzaran a recolectar pequeños trozos de ADN de doble hebra y los dejaran caer en la ruptura de Cas9! Las uniones de estas piezas de ADN parecen microhomologías, pero aún no hemos realizado los experimentos genéticos para decir que esto es causado por un proceso como la unión de extremos mediada por microhomología.

¿Que está pasando aqui?

¿Cómo pueden las alteraciones en la reparación del ADN afectar de manera tan drástica la aparente eficacia de una guía determinada? Creemos que nuestros datos, junto con los datos de otros laboratorios, implican que los recortes de Cas9 son frecuentes perfectamente reparado. Pero esto introduce un ciclo inútil, en el que Cas9 vuelve a unir y vuelve a cortar ese mismo sitio. La única forma en que observamos la edición es cuando se sale de este ciclo a través de una reparación imperfecta, lo que da como resultado un indel. La reparación perfecta tiene mucho sentido para el procesamiento normal del ADN, ya que acumulamos daños en el ADN todo el tiempo en nuestras vidas normales. De hecho, estaríamos en un estado lamentable si este daño resultara con frecuencia en indeles. Parece que la NOE inhibe la reparación perfecta (por ejemplo, ¿titulando Ku?) O mejora la reparación imperfecta (por ejemplo, ¿estimulando una respuesta ATM?), Aunque todavía carecemos de datos directos sobre el mecanismo en este momento.

¿Para que sirve?

La capacidad de estimular la incorporación de ADN bicatenario en una ruptura podría ser útil, ya que la integración no homóloga o mediada por microhomología de casetes bicatenarios se ha utilizado recientemente para etiquetado de genes. Pero no lo hemos intentado explícitamente. También hemos descubierto que NOE es muy útil para el cribado en matriz, en el que la eficiencia de la edición es clave para la penetrancia fenotípica y la llamada de aciertos posterior.

Es importante destacar que la NOE parece funcionar en células primarias, incluidas las hematopoyéticas. células madre y las células T. Lo hemos estado usando al hacer ediciones agrupadas en células humanas primarias no cultivables, y descubrimos que fracciones mucho más altas de células tienen alteraciones genéticas cuando se usa NOE. Hasta ahora solo hemos trabajado en células humanas con RNP, y estoy muy interesado en escuchar la experiencia de las personas usando NOE en otros organismos. No hemos tenido mucha suerte probándolo con plásmidos. expresión de Cas9, pero otros grupos me han dicho que también pueden hacer que funcione en ese contexto.

¿Cómo lo intento?

Entonces, si estás interesado, pruébalo. Todos los detalles están en nuestro reciente Documento de Nature Communications, pero no dude en comunicarse con nosotros si tiene más preguntas. Este trabajo fue realizado por Chris Richardson (el postdoctorado que le trajo recocido de solapas Donantes de HDR), Jordan Ray (un destacado estudiante que ahora es un estudiante de posgrado en el MIT), y Nick Bray (un gurú de la bioinformática postdoctoral).

By maíz jacob

Jacob Corn es profesor de biología del genoma en ETH Zürich. El laboratorio de maíz estudia la intersección de la reparación del ADN humano y las herramientas de edición del genoma y desarrolla nuevos enfoques para curar enfermedades humanas mediante la edición del genoma.