Proteínas Megaphages Harbour Mini-Cas ideales para la edición del genoma

Los megafagos albergan proteínas mini-Cas ideales para la edición del genoma
Noticias de Berkeley | Robert Sanders | 16 de julio de 2020

Video de UC Berkeley por Roxanne Makasdjian

La ADN-corte proteínas central para CRISPR-Cas9 y genoma,-las herramientas de edición provienen originalmente de bacterias fotosintéticas, pero una nueva variedad de Proteínas Cas proteínas aparentemente evolucionaron en virus que infectan bacterias.

Las nuevas proteínas Cas se encontraron en los virus que infectan bacterias más grandes conocidos, llamados bacteriófagos, y son las variantes de Cas más compactas que se han descubierto hasta ahora: la mitad del tamaño del caballo de batalla actual, Cas9.

Las proteínas Cas más pequeñas y compactas son más fáciles de transportar a células que hacer edición del genoma basado en CRISPR, ya que se pueden empaquetar en pequeños vehículos de reparto, incluido uno de los más populares: un desactivado virus , que son virus adenoasociado (AAV). Las proteínas Hypercompact Cas también dejan espacio dentro del AAV para carga adicional.

Como una de las proteínas Cas más pequeñas conocidas hasta la fecha, la recién descubierta CasΦ (Cas-phi) tiene ventajas sobre las herramientas de edición del genoma actuales cuando deben introducirse en las células para manipular los cultivos. los genes o curar enfermedades humanas.

"Los adenovirus son el caballo de Troya perfecto para la producción de editores de genes: puede programar fácilmente los virus para que lleguen a casi cualquier parte del cuerpo", dijo Patrick Pausch, becario postdoctoral en la Universidad de California, Berkeley, y en el Instituto de Genómica Innovadora de UC Berkeley. (IGI), un grupo de investigación conjunto UC Berkeley / UCSF dedicado a descubrir y estudiar herramientas novedosas para la edición del genoma en la agricultura y las enfermedades humanas. “Pero solo se puede empaquetar un Cas9 realmente pequeño en un virus de este tipo para distribuirlo. Si tuviera otros sistemas CRISPR-Cas que son realmente compactos, en comparación con Cas9, eso le da suficiente espacio para elementos adicionales: diferentes proteínas fusionadas a la proteína Cas, plantillas de reparación de ADN u otros factores que regulan la proteína Cas y controlan el gen. -editando el resultado ".

Aparentemente, estos “megafagos” usan la proteína CasΦ (la letra griega Φ, o phi, se usa como abreviatura de bacteriófagos) para engañar a las bacterias para que luchen contra virus rivales, en lugar de a sí mismas.

“Lo que realmente me interesó en estudiar esta proteína específicamente es que todos los sistemas CRISPR-Cas conocidos se descubrieron originalmente en bacterias y Archaea para defenderse de los virus, pero esta fue la única vez que se encontró por primera vez un tipo completamente nuevo de sistema CRISPR-Cas, y hasta ahora solo se encontró, en genomas virales ”, dijo Basem Al-Shayeb, estudiante de doctorado en el IGI. "Eso nos hizo pensar en lo que podría ser diferente acerca de esta proteína, y con eso vinieron muchas propiedades interesantes que luego encontramos en el laboratorio".

Entre estas propiedades: CasΦ evolucionó para ser aerodinámico, combinando varias funciones en una proteína para que pueda prescindir de la mitad de los segmentos proteicos de Cas9. Es tan selectivo para apuntar a regiones específicas de ADN como el Cas9 original. enzima de bacterias, e igualmente eficiente, y funciona en células de bacterias, animales y plantas, lo que lo convierte en un editor de genoma prometedor y de amplia aplicación.

"Este estudio muestra que esta proteína CRISPR-Cas codificada por virus es realmente muy buena en lo que hace, pero es mucho más pequeña, aproximadamente la mitad del tamaño de Cas9", dijo la fundadora de IGI, Jennifer Doudna, profesora de Molecular y Biología Celular y Química e investigador del Instituto Médico Howard Hughes. “Eso es importante, porque podría hacer que sea mucho más fácil enviarlo a las células que lo que estamos encontrando con Cas9. Cuando pensamos en cómo se aplicará CRISPR en el futuro, ese es realmente uno de los cuellos de botella más importantes en el campo en este momento: la entrega. Creemos que este diminuto sistema CRISPR-Cas codificado por virus puede ser una forma de romper esa barrera ".

Pausch y Al-Shayeb son los primeros autores de un artículo que describe CasΦ que apareció hoy en la revista Ciencia.

Biggiephages llevan sus propias proteínas Cas

La proteína CasΦ fue descubierta por primera vez el año pasado por Al-Shayeb en el laboratorio de Jill Banfield, profesora de Ciencias de la Tierra y Planetarias y Ciencias, Políticas y Gestión Ambientales de la Universidad de Berkeley. Los megafagos que contienen CasΦ eran parte de un grupo al que llamaron Biggiephage y se encontraron en una variedad de ambientes, desde charcas primaverales y suelos de bosques saturados de agua hasta lagunas de estiércol de vaca.

"Usamos metagenómica secuenciación para descubrir las bacterias, arqueas y virus en muchos entornos diferentes y luego explorar sus inventarios de genes para comprender cómo funcionan los organismos de forma independiente y en combinación dentro de sus comunidades ”, dijo Banfield. "Los sistemas CRISPR-Cas en fagos son un aspecto particularmente interesante de la interacción entre virus y sus anfitriones".

Si bien la metagenómica permitió a los investigadores aislar el gen que codifica CasΦ, su secuencia solo les dijo que era una proteína Cas en la familia Tipo V, aunque evolutivamente distante de otras proteínas Cas Tipo V, como Cas12a, CasX (Cas12e) y Cas14. . No tenían idea de si era funcional como sistema inmunológico contra el ADN extraño. El estudio actual mostró que, de forma similar a Cas9, CasΦ se dirige y escinde genomas extraños en células bacterianas, así como doble hebra ADN en células renales embrionarias humanas y células de la planta Arabidopsis thaliana. También puede apuntar a una gama más amplia de secuencias de ADN que Cas9.

La capacidad de CasΦ para cortar ADN de doble hebra es una gran ventaja. Todas las demás proteínas Cas compactas cortan preferentemente ADN monocatenario. Entonces, si bien pueden encajar perfectamente en sistemas de administración compactos como AAV, son mucho menos útiles cuando se editan ADN, que es de doble hebra, dentro de las células.

Como fue el caso después de que la destreza de edición del genoma de Cas9 fuera reconocida por primera vez en 2012, hay mucho espacio para optimizar CasΦ para la edición del genoma y descubrir las mejores reglas para diseñar ARNs guía para apuntar a genes específicos, dijo Pausch.

Otros coautores del artículo son Ezra Bisom-Rapp, Connor Tsuchida, Brady Cress y Gavin Knott de UC Berkeley, y Zheng Li y Steven E. Jacobsen de UCLA. Los investigadores fueron financiados, en parte, por Paul G. Allen Frontiers Group, National Institutes of Health Somático Consorcio Cell Genome Editing (U01AI142817-02) y National Science Foundation (DGE 1752814).

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