Si bien las guerras humanas pueden durar cientos de años brutales, no son nada en comparación con la batalla en curso entre bacterias fotosintéticas y virus que los contagian, bacteriófagos. Esta amarga disputa se ha extendido durante cientos de millones de años, alimentando la llamada "carrera armamentista evolutiva". Las bacterias han construido varios refuerzos moleculares para hacer retroceder el ataque viral, pero todas estas defensas pueden superarse. Eventualmente, el procariotes evolucionó un sistema inmunológico adaptativo: CRISPR. Al igual que su contraparte humana, esta potente vía permite a las bacterias recordar amenazas pasadas y aniquilar rápidamente a los invasores virales que regresan. Podrías pensar que la historia terminaría ahí, pero el fago contraatacó con un fascinante arsenal de "anti-CRISPR" proteínas.
Buscad y hallaréis
El primer CRISPR-Proteínas Cas Los inhibidores del sistema se revelaron en enero de 2013, aproximadamente al mismo tiempo que Cas9-mediada edición del genoma basado en CRISPR se demostró con éxito en humanos células. Alan Davidson y su laboratorio estaban estudiando la biología de los bacteriófagos en la Universidad de Toronto y se preguntaban por qué los fagos habían podido superar tantas defensas bacterianas pero no parecían poder eludir CRISPR. Junto con la experta en fagos y colaboradora frecuente Karen Maxwell, predijeron que podría existir una actividad “anti-CRISPR” codificada por fagos y se dispusieron a buscarla.
La caza dio sus frutos, produciendo cinco familias distintas de fagos. los genes que inhiben el sistema IF CRISPR en Pseudomonas aeruginosa. Después de este descubrimiento histórico, el mismo grupo encontró cada vez más genes que codifican proteínas anti-CRISPR, 14 familias en total. Hasta ahora, todas las proteínas identificadas son diminutas, de solo 50 a 150 residuos de longitud (~ 10 a 20 kDa). Muchas de las proteínas bloquean el sistema de FI, otras se dirigen a la IE y una, descubierta conjuntamente con Peter Fineran, ¡en realidad inhibe a ambas! A diferencia del sistema optimizado de Tipo II, con su único ejecutor, Cas9, los sistemas de Tipo I emplean un complejo de interferencia de múltiples proteínas llamado cascada atar ADN objetivos y reclutar a los nucleasa-helicasa Cas3 para destruirlos. Los complejos efectores de diferentes subtipos poseen distintas subunidades con una homología de secuencia extremadamente baja, por lo que la inhibición de subtipos cruzados por un anti-CRISPR fue inesperada e intrigante.
Resumen de publicaciones anti-CRISPR hasta la fecha.
Las proteínas diminutas tienen un gran impacto
Este hallazgo se produjo tras otra sorpresa mecanicista. Un año antes, el equipo canadiense publicó un artículo increíble que mostraba cómo cada una de las proteínas inhibidoras de IF identificadas inhibe el funcionamiento de CRISPR de una manera única. Colaboraron con Blake Wiedenheft, un experto en el complejo de interferencia IF y un actor central en la investigación de biología CRISPR. Juntos, descubrieron que dos de los anti-CRISPR bloquean el complejo IF para que no se una al ADN, pero se unen a diferentes conjuntos de subunidades. Otro se adhiere a Cas3 e impide su reclutamiento al complejo IF.
Esta interacción se detalló aún más en el verano de 2016, cuando un nuevo grupo entró en juego y cristalizó el co-complejo inhibidor-Cas3. Este anti-CRISPR parece actuar como un dímero, evitando que Cas3 hidrolice el ATP, se una al ADN o entre en contacto con el complejo de interferencia. Otro grupo de recién llegados publicó una estructura similar y uno de los anti-CRISPR solo unos meses después. A continuación, los grupos de Maxwell y Davidson publicaron una estructura de RMN de una proteína anti-CRISPR diferente y mapearon su interfaz funcional.
Estructuras atómicas de proteínas anti-CRISPR unidas a la proteína Cas que inhiben (izquierda) o solas (derecha).
Estos estudios de estructura-función indican que las proteínas anti-CRISPR son armas versátiles y poderosas, especialmente cuando un fago porta más de uno o co-infecta con otro procariota bien armado. virus. Incluso si las proteínas Cas evolucionan para enmascarar la superficie de unión de un inhibidor, otro widget anti-CRISPR todavía funcionará.
Todos juntos ahora
Siguiendo su fructífera colaboración, Davidson, Maxwell y Wiedenheft se unieron con el experto en microscopía crioelectrónica Gabe Lander y se embarcaron en estudios estructurales. En un artículo de tour-de-force publicado en línea a fines de marzo de 2017, la tripulación determinó un modelo atómico del complejo de interferencia IF adornado con tres proteínas anti-CRISPR. Esta no solo es la primera estructura de alta resolución del complejo efector IF, sino que también es la primera estructura que muestra cómo múltiples inhibidores pueden unirse y paralizar simultáneamente un complejo CRISPR, proporcionando fascinantes conocimientos mecánicos.
Uno de los anti-CRISPR evita que el complejo se una al ADN diana al adherirse a dos de las proteínas de la columna vertebral que se repiten. Debido a que hay seis de estas subunidades, la estructura acomoda dos copias separadas de este inhibidor, y su trabajo previo sugiere que hasta tres pueden unirse simultáneamente. Para mí, el hallazgo más notable es que la otra proteína anti-CRISPR parece funcionar imitando elegantemente doble hebra ADN (ver más abajo). Leer el documento completo esta página.
Cargas negativas (rojo y naranja) en el ADN en forma B y en la proteína anti-CRISPR AcrF2, donde se disponen en un patrón pseudo-helicoidal.
Edición de genes con tijeras de seguridad.
Además del emocionante progreso que caracteriza a los inhibidores de CRISPR de tipo I, a finales de 2016 se dieron a conocer las primeras proteínas anti-CRISPR que obstaculizan un sistema de tipo II. Junto con Erik Sontheimer, moléculas de ARN biólogo e innovador de CRISPR, el equipo de Toronto encontró tres nuevas familias de anti-CRISPR que inhiben específicamente la proteína Tipo II-C Cas9 de Neisseria meningitidis. Los inhibidores se unen directamente a Cas9 y se pueden usar para bloquear tanto genoma, edición y represión transcripcional a través de CRISPRi en células humanas cultivadas.
En menos de unas semanas en el nuevo año, el miembro de la facultad de UCSF y alumno de laboratorio de Davidson, Joe Bondy-Denomy, describieron cuatro anti-CRISPR más dirigidos a sistemas de Tipo II. Curiosamente, estas proteínas recién descubiertas inhiben el tipo de Cas9 más utilizado para la edición de genes, el efector Tipo II-A de Streptococcus pyogenes. En consecuencia, estos anti-CRISPR se pueden usar para disminuir tanto la edición del genoma como la represión de genes en células humanas.
Hay un buen resumen en video para complementar el documento de 2016, échale un vistazo a continuación:
¿Qué es lo siguiente?
Los investigadores han identificado 21 familias de proteínas anti-CRISPR hasta la fecha. No tengo el espacio para entrar en los enfoques interesantes utilizados para encontrar estos nuevos inhibidores, pero espero que se descubran más y más anti-CRISPR a través de estos y métodos futuros. Espero ver inhibidores de los sistemas de Tipo III, que emplean los complejos Csm y Cmr, así como proteínas efectoras únicas de Clase II distintas de Cas9: Cas12a (Cpf1), Cas12b (C2c1), Cas13a (C2c2), Cas13b, CasX, CasY y cualquier otra cosa que venga por la pica.
Más allá de la interesante biología, los inhibidores Cas9 son adiciones bienvenidas a la caja de herramientas de manipulación del genoma. Si bien los científicos han inventado muchos esquemas Cas9 inducibles, no ha habido interruptores de apagado. Los anti-CRISPR agregan otra capa de control a la ingeniería genética. Potencialmente, podrían usarse para evitar fuera del objetivo ediciones, inactivar el corte en tejidos que no son el objetivo o bloquear la actividad en etapas inapropiadas del ciclo celular o del desarrollo, particularmente para evitar eventos de edición que causan mosaicismo no deseado en embriones animales. Los interruptores de apagado CRISPR-Cas9 pueden ser especialmente importantes en las discusiones e investigaciones en curso hacia impulso genético diseño y bioseguridad.
Estoy seguro de que hay muchas aplicaciones que ni siquiera puedo imaginar. Que bien el in vitro y el trabajo de cultivo celular se traduce en su uso en un organismo vivo, pero será genial ver qué se le ocurre a la gente. Los anti-CRISPR ya se han abierto camino en ciencia ficción tramas, ¿quién sabe dónde terminarán después?
