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Las proteínas anti-CRISPR reducen los efectos fuera del objetivo de Cas9
Las proteínas anti-CRISPR reducen los efectos secundarios fuera del objetivo de CRISPR-Cas9
Noticias de Berkeley | Robert Sanders | 12 de julio de 2017
CRISPR-Cas9 edición de genes se basa en una táctica bacterias fotosintéticas desarrollado para protegerse de virus.
La investigación ahora muestra que surgieron los virus de contramedida: inhibidores proteínas denominados anti-CRISPR: se puede utilizar para mejorar CRISPR-Cas9 como gen-herramienta de terapia, decreciente fuera del objetivo edición de genes que podrían causar efectos secundarios no deseados.
En un estudio publicado en línea esta semana en la revista Science Advances, investigadores de UC Berkeley y UC San Francisco muestran que las proteínas anti-CRISPR recientemente descubiertas reducen los efectos fuera del objetivo hasta en un factor de cuatro, actuando como un interruptor de apagado para desactivar CRISPR-Cas9 después de que haya hecho su trabajo.
El estudio demostró que una proteína anti-CRISPR en particular llamada AcrIIA4 redujo cuatro veces los efectos fuera del objetivo de una molécula CRISPR-Cas9 que usa un un ARN guía para encontrar, recortar y reemplazar el mutado gen de la hemoglobina responsable de la hoz (SCD por sus siglas en inglés), enfermedad. Lo hace sin reducir significativamente la edición de genes deseada en el objetivo.
"Pueden surgir mutaciones inesperadas como resultado de la edición de genes fuera del objetivo, pero nuestro artículo, como muchos otros, muestra que los efectos fuera del objetivo se pueden modular y no es tan grave como la gente podría pensar", dijo Jiyung, becario postdoctoral de UC Berkeley. Jenny Shin, del laboratorio de Jacob Corn en el Innovative Genómica Institute y uno de los tres primeros autores del artículo.
En sus experimentos con células humanas en cultivo, Shin descubrió que administrar CRISPR-Cas9 y luego, varias horas después, la proteína anti-CRISPR, era la forma más eficaz de reducir los efectos fuera del objetivo. La proteína imita ADN, glomming en Cas9, el enzima que en realidad corta el doble hebra ADN, y evitar más cortes.
“Incluso después de seis horas de CRISPR efectivo, la inserción de anti-CRISPR reduce los efectos fuera del objetivo en más del doble en comparación con en el objetivo, ”Dijo Shin. "Terapéuticamente, podría tratar a un paciente con CRISPR primero y luego tratar con anti-CRISPR en un momento posterior y disminuir los efectos fuera del objetivo".
El investigador que descubrió AcrIIA4, Joseph Bondy-Denomy de UC San Francisco, prevé que estas proteínas anti-CRISPR se convertirán en una parte estándar de CRISPR. terapias de genes, administrado junto con CRISPR-Cas9 para deshabilitar la edición de genes después de un período de tiempo fijo para evitar cortes aleatorios fuera del objetivo.
"Este inhibidor de Cas9 podría codificarse en la misma pieza de ADN que Cas9, por ejemplo, programado con precisión para apagar Cas9 después de que se realiza la edición del gen, en lugar de dejar que Cas9 permanezca en la célula y se arriesgue a efectos fuera del objetivo", dijo Bondy. -Denomy, quien también es coautor del artículo.
Enlace anti-CRISPR
El equipo incluyó a investigadores del laboratorio de Jennifer Doudna, una de las inventoras de la edición del gen CRISPR-Cas9, quien determinó cómo la proteína anti-CRISPR se une al complejo CRISPR-Cas9. Usando microscopía crioelectrónica, encontraron que anti-CRISPR esencialmente imita al ADN, engañando a CRISPR-Cas9 para que se una a él y luego nunca lo suelte.
El inhibidor de CRISPR se dirige a un punto de la proteína Cas9 que es tan esencial para la función de Cas9 que no puede operar para cortar el ADN cuando está unido por el anti-CRISPR.
El año pasado, Bondy-Denomy informó haber encontrado cuatro proteínas anti-CRISPR utilizadas por los virus atacantes para inactivar la versión de la proteína Cas9 que se encuentra en la bacteria. Listeria monocytogenes. Dos de estos también inhibieron la proteína Cas9 más utilizada por los investigadores, que está adaptada de la bacteria. Streptococcus pyogenes y se conoce como SpyCas9. Otro equipo encontró otras tres proteínas anti-CRISPR que funcionan contra una proteína Cas9 diferente pero prometedora adaptada de la bacteria Neisseria meningitidis.
El estudio actual analizó el efecto de una de las proteínas de Listeria, AcrIIA4, en SpyCas9 cargado con una guía moléculas de ARN que se aloja en complementario ADN para unir y cortar.
La investigación en UC Berkeley y en otros lugares sugiere que CRISPR-Cas9 finge constantemente con el sistema de reparación del ADN de la célula: a medida que la enzima corta en su sitio objetivo, la célula repara el ADN y CRISPR-Cas9 vuelve a cortar, repitiendo este círculo vicioso hasta que surge una mutación. en el ADN que previene la unión de la enzima, momento en el que la molécula CRISPR-Cas9 avanza para encontrar otro sitio de unión.
El trabajo actual de los laboratorios de Corn y Doudna ahora sugiere que agregar un anti-CRISPR después de que Cas9 haya editado con éxito un gen objetivo evitaría daños no deseados en otras partes de un genoma,.
"La capacidad de desactivar la edición del gen Cas9 es tan importante como la capacidad de activarla", dijo Corn, director científico de biomedicina del IGI y profesor adjunto adjunto de UC Berkeley de biología celular y molecular. “¡Imagínese si tuviera una maquinilla de afeitar eléctrica sin interruptor de apagado! Para eventuales aplicaciones terapéuticas, es fundamental poder controlar con precisión cuándo y dónde está activa la edición de genes. Las proteínas anti-CRISPR ofrecen oportunidades para apagar completamente Cas9, así como para ajustar su actividad ".
"Los datos de Jenny sugieren que existe una ventana de tiempo ideal para dejar que Cas9 haga su trabajo y luego apagarlo después de que haya pasado esa cantidad de tiempo", dijo Bondy-Denomy. "De hecho, podemos usar las proteínas anti-CRISPR como herramientas para averiguar cuál es esa ventana de tiempo, es decir, para cualquier tipo de célula con cualquier secuencia de ARN guía, cuánto tiempo queremos que Cas9 esté activo en la célula".
Shin y los becarios posdoctorales Fuguo Jiang y Jun-Jie Liu son los tres primeros autores del artículo, que también fue coautor de Benjamin Rauch de UCSF y el posdoctorado Nicolas Bray, el investigador Seung Hyun Baik y la profesora Eva Nogales, además de Corn y Doudna, del IGI y del Departamento de Biología Celular y Molecular de UC Berkeley. Doudna y Nogales son investigadores del Instituto Médico Howard Hughes.
El trabajo fue apoyado en parte por el HHMI, la Fundación Li Ka Shing, el Instituto de Investigación Médica Heritage y el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento.
