La pequeña enzima que puede: conozca al editor de genes CasX

Del misterio al descubrimiento: CasX se convierte en "Cas !!!"

Los científicos usan la letra "X" para designar lo misterioso (como los rayos X y la X cromosoma, cuando ambos fueron descubiertos por primera vez). Conozca la entrada más reciente, CasX, cuyo misterio fue descifrado por un equipo de "detectives" en el Innovative Genómica Instituto. Dos descubrimientos emblemáticos del siglo pasado: recombinante ADNy edición de genes CRISPR-Proteínas Cas proteínas- salió del estudio de microbios, que es donde CasX, un miembro inicialmente desconcertante de la familia CRISPR, se encontró por primera vez. CRISPR-Cas es como un procesador de textos para el ADN de la vida células, y brinda a los científicos biomédicos, agrónomos y médicos un pase de "acceso total" a las células y organismos de ingeniería. En todas las tecnologías, lo excelente es un rival saludable de lo bueno. Publicado hoy en Naturaleza, los científicos han descubierto que CasX, que es físicamente más pequeño que otros editores y tiene una forma diferente, golpea muy por encima de su peso y es un formidable gen editor. El tamaño sí importa, y lo pequeño es mejor, si la ingeniería genética es la tarea que tenemos entre manos.

Enseñarle a un perro nuevo trucos antiguos y nuevos

En el procesamiento de textos, usamos un mouse para hacer clic en el lugar que queremos editar. los enzima CRISPR-Cas9 se encuentra en casi todos los laboratorios de biología del mundo porque puede dirigirse a "hacer clic" en un gen de interés utilizando un principio asombrosamente simple: dale un pequeño trozo de moléculas de ARN que coincide con el gen, y la enzima encontrará ese gen en una célula viva y lo cortará. Esto permite a los científicos intercambiar, insertar o eliminar secuencias de ADN con notable facilidad. En 2012, Cas9 se convirtió en la primera enzima de este tipo en ser descubierta y adaptada para este propósito. Desde entonces, los científicos han descubierto muchas otras proteínas Cas (asociadas a CRISPR). Así como el ciclotrón de Berkeley condujo al descubrimiento de nuevos elementos químicos, también se encontraron muchas proteínas Cas nuevas en UC Berkeley. En diciembre de 2017, los laboratorios de Jennifer Doudna y Jill Banfield descubrieron dos nuevos tipos de proteínas CRISPR que eran bastante diferentes a todas las anteriores; se llamaron CasX y CasY, ya que no estaba claro qué hacían en realidad. ¿Podrían estas misteriosas proteínas compararse o rivalizar con su famoso predecesor, Cas9?

¿No es lo excelente enemigo de lo bueno? No en el desarrollo de tecnología. “Si bien las proteínas actuales como Cas9 y Cas12 son sólidos en un entorno de investigación, lo que es importante en la clínica es en realidad bastante distinto del laboratorio ”, dice el coautor principal Ben Oakes, que dirige un grupo de investigación a través del Programa de becarios emprendedores del IGI, y se centra en el desarrollo de aplicaciones prácticas de CRISPR . Oakes se mostró optimista de que CasX podría ser una solución a un desafío conocido: otros editores basados ​​en CRISPR son físicamente grandes y provienen de bacterias fotosintéticas que infectan a los seres humanos. Para su uso en la clínica, esto significa que los científicos deben enfrentar obstáculos logísticos de entrega e inmunogenicidad.

Los científicos y médicos que trabajan en la edición de genes como tratamiento terapéutico tienen una broma sombría: ¿qué tres cosas importan en la edición de genes? Entrega, entrega y entrega. Si no puede colocar el editor de genes dentro de su célula u órgano objetivo, fallará. Para introducir Cas9 en células específicas del cuerpo, los científicos a menudo usan un camión de reparto molecular: un transportador virus , que son AAV. Si bien es ágil, AAV tiene una capacidad de carga limitada, y esto significa tener que lidiar con empaquetar herméticamente la maquinaria o las instrucciones necesarias para genoma, edición. CasX es bastante (¡~ 40%!) Más pequeño que el editor de genes más utilizado, Cas9, y esto significa que empaquetar CasX en recipientes AAV podría dejar espacio para otras herramientas y accesorios de edición del genoma. ¿Qué pasa si el pequeño tamaño de CasX viene con una penalización sobre lo que puede hacer? Los científicos ahora demuestran definitivamente que CasX es un editor y regulador de genes potente y eficiente; por lo tanto, la caja de herramientas de edición de genes ahora tiene un luchador poderoso no solo en su clase de peso pluma sino en todas las categorías.

El pequeño tamaño de CasX no es su única característica notable: también lo son sus orígenes: CasX se encontró en una bacteria a la que los seres humanos nunca están expuestos. ¿Por qué es esto interesante? Muchas de las mejores proteínas Cas9 utilizadas para la edición del genoma provienen de bacterias que comúnmente residen en el cuerpo humano o dentro de él; como resultado, varias personas tienen un recuerdo inmune de haber estado expuestas a Cas9. ¿Qué pasará en un ser humano con tal memoria que sea tratado con Cas9 para la edición de genes? La respuesta no se conoce, pero está en la mente de todos los que usan Cas9 para ensayos clínicos, algunos de los cuales están en camino.

"La inmunogenicidad, la entrega y la especificidad de una herramienta de edición del genoma son de vital importancia", dice Oakes. "Estamos entusiasmados con CasX en todos estos frentes".

En una liga propia

Después de determinar que CasX puede editar ADN, el equipo de investigación se propuso comprender cómo funciona esta poderosa máquina y cómo podrían mejorarla. Al igual que en la renovación de una casa, un ingeniero debe tener un plano detallado antes de reorganizar las tuberías o cables, por lo que el equipo se puso en marcha para trazar un plano de ese tipo.

A primera vista, CasX parece actuar como sus predecesores Cas9 y Cas12; el plano de resolución fina de la enzima cuenta una historia diferente. Los coautores principales Jun-Jie Liu y Natalia Orlova utilizaron un enfoque de tour de force, conocido como microscopía crioelectrónica: tomaron cientos de miles de imágenes de CasX y las combinaron para construir un retrato átomo por átomo de la misma. . El resultado no fue un simple bodegón: Liu y Orlova capturaron instantáneas de la proteína CasX realizando los movimientos de edición de un gen. Esta película atómica brinda pistas esenciales sobre cómo usar CasX en la edición.

El montaje de la película reveló una asombrosa hazaña de evolución. Un delfín parece un pez, pero es un mamífero, cuyos antepasados ​​evolucionaron a la "pesca" de forma bastante independiente de los peces reales. De la misma manera, CasX corta con precisión tanto hebras de la doble hélice del ADN, al igual que Cas9 y enzimas relacionadas; pero esta es una habilidad que parece haber aprendido por sí sola. Basado en la composición y forma molecular únicas de la proteína, CasX evolucionó independientemente de Cas9, sin compartir un ancestro común. “Lo primero que destaca es cómo los dominios altamente únicos cumplen funciones similares a las que hemos visto con otras proteínas de unión al ADN guiadas por ARN. El tamaño mínimo de CasX, sin grasa en el hueso, ayuda a demostrar claramente que existe una receta básica que usa la naturaleza ”, dice Oakes. "Comprender esta receta nos ayudará a evolucionar mejor y diseñar herramientas de edición del genoma para nuestros propósitos en lugar de los de la naturaleza".

Expandiendo y explotando CasX

Más allá de conformarse con lo que ha evolucionado la naturaleza, Oakes planea diseñar CasX para una funcionalidad especializada y una eficiencia de edición mejorada. “Estamos muy emocionados de construir sobre el diseño de la naturaleza y diseñar proteínas CRISPR nuevas y más efectivas, ya que nuestro el trabajo reciente en ProCas9 ha demostrado. El desarrollo de proteínas CRISPR para fines específicos ampliará enormemente el alcance y el valor de la tecnología CRISPR para la sociedad ". La historia continúa mientras Oakes y sus colegas comienzan a probar otros homólogos, o sabores, de proteínas CasX, identificando candidatos prometedores para aplicaciones terapéuticas.

La colaboración entre un conjunto diverso de grupos de investigación en el IGI y en todo el campus de UC Berkeley ha dado lugar a una interesante línea de descubrimiento de proteínas CRISPR y su reutilización en herramientas de edición del genoma. “La culminación de la bioquímica, la edición del genoma y los experimentos de estructura dentro de este único estudio es un excelente ejemplo de los esfuerzos integrales que se están llevando a cabo en el IGI”, dice Jennifer Doudna, Directora Ejecutiva de IGI. “No solo buscamos descubrir el próximo par de tijeras moleculares. Queremos construir la próxima navaja suiza ".

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Este estudio fue publicado en la edición en línea de la revista Nature como “Las enzimas CasX comprenden una familia distinta de editores del genoma guiados por ARN. " Además de Oakes, Liu y Orlova, otros autores son Enbo Ma, Hannah B. Spinner, Katherine LM Baney, Jonathan Chuck, Dan Tan, Gavin J. Knott, Lucas B. Harrington, Basem Al-Shayeb, Alexander Wagner, Brett T. Staahl, Kian L. Talyor, Julian Brotzman, Eva Nogales y Jennifer Doudna. Esta investigación fue financiada por el Programa de becarios emprendedores del Instituto de Genómica Innovadora, los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Médico Howard Hughes y la Fundación Nacional de Ciencias.

El Innovative Genomics Institute (IGI) es una asociación académica sin fines de lucro entre UC Berkeley y UC San Francisco que apoya proyectos de investigación colaborativa en el Área de la Bahía. La misión del IGI es desarrollar e implementar la ingeniería del genoma para curar enfermedades, garantizar la seguridad alimentaria y mantener el medio ambiente para las generaciones actuales y futuras. Como pioneros en la edición del genoma, la genómica funcional y otras tecnologías de vanguardia, los científicos de IGI amplían continuamente los límites de la ciencia.

Contactos para los medios de comunicación
Megan Hochstrasser: megan.hochstrasser@berkeley.edu
Benjamín Oakes: oakes@berkeley.edu