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Los investigadores de IGI aumentan la eficiencia de CRISPR-Cas9
CRISPR-Cas9 rompe los genes mejor si interrumpe la reparación del ADN
Noticias de Berkeley | Robert Sanders | 17 de agosto de 2016
CRISPR-Cas9 es la técnica de referencia para noquear los genes en humanos (SCD por sus siglas en inglés), líneas para descubrir qué hacen los genes, pero la eficiencia con la que desactiva los genes puede variar enormemente.
Los investigadores de UC Berkeley ahora han encontrado una manera de aumentar la eficiencia con la que CRISPR-Cas9 corta y deshabilita genes hasta cinco veces, en la mayoría de los tipos de células humanas, lo que facilita la creación y el estudio de líneas celulares knockout y, potencialmente, deshabilita un mutante gen como una forma de terapia humana.
Los científicos están descubriendo constantemente nuevos genes o la proteínas codifican, pero es mucho más difícil determinar su función en el cuerpo o en la enfermedad. La clave para descubrir esta función es deshabilitar el gen para ver qué sucede cuando se elimina.
Cortes CRISPR-Cas9 ADN: El complejo CRISPR-Cas9 (violeta) corta un fragmento específico de ADN repetidamente hasta que se repara la célula. enzimas CRISPR-Cas cometer un error al parchear el corte, desactivando efectivamente el gen. Los científicos de UC Berkeley lograron un éxito de corte mucho mayor al interferir con el proceso de reparación del ADN, aumentando la probabilidad de un parche fallido. Este gráfico muestra el ARNs guía (morado) ese par con complementario ADN (azul) y alinee la proteína Cas9 para cortar con precisión los dos hebras de ADN (estrellas blancas).
Si bien CRISPR-Cas9 puede acelerar el proceso de creación de líneas celulares knockout, los investigadores a veces deben crear y analizar muchas variaciones de las tijeras genéticas para encontrar una que funcione bien. Los investigadores de UC Berkeley encontraron que este proceso se puede hacer mucho más eficiente con un simple ajuste.
La clave es introducir en la célula, junto con la proteína CRISPR-Cas9, fragmentos cortos de ADN que no coinciden con ninguna secuencia de ADN en el ser humano. genoma,. Los fragmentos cortos de ADN, llamados oligonucleótidos, parecen interferir con los mecanismos de reparación del ADN en la célula para aumentar el rendimiento de edición incluso de CRISPR-Cas9s mediocres entre 2½ y 5 veces.
"Resulta que si haces algo realmente simple, simplemente alimentar a las células con oligonucleótidos sintéticos económicos que no tienen homología en ninguna parte del genoma humano, las tasas de edición aumentan hasta cinco veces", dijo el investigador principal Jacob Corn, director científico de UC Bekeley's Innovative Genómica Initiative y profesor adjunto adjunto de biología celular y molecular. La técnica aumenta la eficiencia de todos los CRISPR-Cas9, incluso aquellos que inicialmente no funcionaron.
Con una mayor eficiencia, los investigadores tendrán más éxito en la creación de los knockouts que desean y luego usarán esas líneas celulares knockout para explorar la función de un gen o un grupo de genes. Debido a que la mayoría de las líneas celulares de larga vida se derivan de células cancerosas células, incluida la muy popular línea celular HeLa, estas líneas celulares suelen tener más de las dos copias normales de cada gen. Esto puede dificultar la eliminación de todas las copias a la vez, y una mayor eficiencia aumenta en gran medida las posibilidades de éxito.
La alta eficiencia también es esencial cuando se eliminan genes para corregir mutaciones hereditarias en humanos. Los médicos han especulado sobre la eliminación de genes que hacen que las personas sean susceptibles a enfermedades infecciosas, como el SIDA, o propensas a trastornos autoinmunitarios, inflamatorios o neurodegenerativos. Queda por ver si el enfoque descrito por Corn y sus colegas podría utilizarse en un contexto terapéutico, pero es muy eficaz para fines de investigación.
Los resultados se publicarán el 17 de agosto en la revista en línea Nature Communications.
La reparación del ADN es clave para el éxito de CRISPR-Cas9
La molécula CRISPR-Cas9 consta de unas tijeras de proteína, la proteína Cas9 y una dirección que le indica a Cas9 dónde unir el ADN y cortar. La técnica se basa en el hecho de que cuando se corta el ADN, los mecanismos de reparación de la célula no siempre reconstruyen correctamente la cadena de ADN, sino que cometen un error en la secuencia que desactiva el gen y anula su actividad.
Esa dirección, llamada guía moléculas de ARN, es una cadena de 20 moléculas de ácido ribonucleico que son complementarias a la secuencia de ADN del gen diana. Este ARN guía se une al ADN como una tira de velcro, configurando Cas9 para cortar el ADN de doble hebra.
Por qué algunos ARN guía funcionan bien, configurando Cas9 para cortar y deshabilitar un gen casi el 100 por ciento de las veces, mientras que otros se unen pero rara vez o nunca eliminan el gen, ha sido un enigma desde que la técnica fue inventada por Jennifer Doudna de UC Berkeley. y Emmanuelle Charpentier de la Universidad de Umea en 2012. La eficiencia de corte varía con el tipo de célula y la línea celular en particular, dijo Corn.
Corn sospechaba que la eficiencia de corte ocasionalmente pobre de Cas9 podría estar relacionada con la forma en que se repara el ADN, ya que los mecanismos de reparación del ADN, las enzimas domésticas básicas que corrigen cualquier ruptura o deleción en el ADN que podría conducir a una mutación mortal, difieren de una célula a otra. Razonó que las hebras de ADN aleatorias, ninguna de ellas similar a ningún ADN humano real (es decir, no homólogo), podrían confundir el proceso de reparación y mejorar la tasa de éxito por nocaut.
“Le da a la celda una pequeña patada para evitar que se produzca la reparación normal”, dijo.
Retrata CRISPR-Cas9 edición de genes como una competencia entre el corte y la reparación del ADN: una vez que Cas9 corta, la célula reemplaza exactamente el ADN cortado, que Cas9 corta de nuevo, en un ciclo interminable de corte y reparación hasta que las enzimas reparadoras cometen un error y el gen termina siendo disfuncional. Quizás, dijo, los oligonucleótidos disminuyen la fidelidad del proceso de reparación o hacen que la célula cambie a una reparación más propensa a errores que permita que Cas9 rompa más fácilmente el gen.
La próxima frontera, dijo, es tratar de aprovechar las peculiaridades de la reparación del ADN para mejorar la inserción de secuencias, con el fin de reemplazar un gen defectuoso con un gen normal y posiblemente curar una enfermedad genética.
La investigación, en coautoría de los becarios postdoctorales Chris Richardson y Nicolas Bray y el ex investigador asociado Jordan Ray, fue financiada por la Fundación Li Ka Shing.
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