Las 'tijeras' de Blunting CRISPR brindan una nueva perspectiva sobre los trastornos autoinmunes

Las 'tijeras' de Blunting CRISPR brindan una nueva perspectiva sobre los trastornos autoinmunes
Centro de noticias de UCSF | Pete Farley | 30 de agosto de 2017

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El nuevo método permite '20,000, XNUMX experimentos paralelos 'en la búsqueda de gen activadores

Cada uno de nuestros células tiene los mismos 22,000 genes en su genoma,, pero cada uno usa combinaciones diferentes de esos mismos genes, activándolos y desactivándolos según lo exija su función y situación. Son estos patrones de expresados y genes reprimidos que determinan en qué tipo de célula (riñón, cerebro, piel, corazón) se convertirá cada uno.

Para controlar estos patrones cambiantes, nuestros genomas contienen secuencias reguladoras que activan y desactivan los genes en respuesta a señales químicas específicas. Entre estos se encuentran los "potenciadores", secuencias que pueden ubicar a decenas de miles de letras genéticas alejadas de un gen, pero aún así lo fuerzan a sobremarcha cuando se activan. Los pasos en falso en esta delicada coreografía pueden llevar a las células a asumir el papel equivocado, provocando enfermedades debilitantes, pero las regiones reguladoras involucradas son difíciles de encontrar y estudiar, ya que solo juegan un papel en células específicas, a menudo en condiciones muy específicas.

Ahora, un equipo de investigación dirigido por científicos de la Universidad de California ha utilizado una versión modificada de la técnica de edición de genes. CRISPR para encontrar potenciadores, no editándolos, sino impulsándolos a la acción. Como se informó en línea el 30 de agosto de 2017 en Naturaleza, un equipo de UC San Francisco y la Universidad de California, Berkeley, utilizó una herramienta llamada activación CRISPR (CRISPRa), desarrollado en UCSF en 2013, para buscar potenciadores de un gen que afecta el desarrollo de las células inmunes conocidas como las células T. Las secuencias que encontraron iluminan los circuitos fundamentales de los trastornos autoinmunes como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y la enfermedad de Crohn.

El trabajo se realizó en los laboratorios de Alejandro Marson, MD, PhD, profesor asistente de microbiología e inmunología en UCSF, y maíz jacob, PhD, profesor adjunto asistente de biología celular y molecular en Berkeley.

“No solo podemos ahora encontrar estas regiones reguladoras, sino que podemos hacerlo de manera tan rápida y sencilla que es alucinante”, dijo Corn. “Habría llevado años encontrar solo uno antes, pero ahora una sola persona solo necesita unos meses para encontrar varios”.

Corn es cofundador y director científico de Innovative Genómica Institute (IGI), una iniciativa de Berkeley-UCSF de la que Marson es miembro afiliado. El IGI tiene como objetivo avanzar basado en CRISPR edición del genoma en medicina y agricultura para curar enfermedades humanas, acabar con el hambre y proteger el medio ambiente. En febrero, Marson fue incluido en el grupo inaugural de Chan Zuckerberg Biohub Investigators, una cohorte de investigadores de UCSF, Berkeley y la Universidad de Stanford.

CRISPRa activa potenciadores

La llegada de CRISPR ha permitido a los investigadores avanzar rápidamente en la comprensión proteína-genes codificadores. En la aplicación más común de CRISPR, un enzima , que son Cas9 recortes letra singular en secuencias particulares especificadas por la secuencia de un "un ARN guía. " Con la tecnología, los científicos pueden extirpar o editar cualquier gen y observar cómo estos cambios afectan a las células u organismos completos.

Pero las secuencias que codifican directamente proteínas constituyen solo el 2 por ciento de nuestro genoma. Los potenciadores y otros elementos reguladores del ADN diseminados por el otro 98 por ciento son más difíciles de estudiar, pero están implicados en una gran cantidad de trastornos genéticos. Los científicos pueden buscar secuencias potenciadoras potenciales basándose en cómo interactúan con las proteínas que se unen al ADN, pero descubrir qué potenciadores funcionan con qué genes es mucho más complicado. Simplemente cortar un potenciador con CRISPR-Cas9 no ayuda, porque no tendrá un efecto notable si el potenciador está inactivo en el tipo de célula particular utilizado en un experimento.

Si piensa en el genoma como una casa modelo con 22,000 bombillas (los genes) y cientos de miles de interruptores (los potenciadores), los desafíos han sido encontrar todos los interruptores y averiguar qué bombillas controlan y cuándo. Anteriormente, CRISPR se usaba para cortar cables en busca de aquellos que harían que una bombilla se apagara, dando una buena idea de lo que estaba haciendo esa sección del circuito. Sin embargo, cortar un interruptor de luz cuando está apagado no le dice nada sobre lo que controla. Entonces, para encontrar ciertos interruptores de luz, ha sido común intentar imitar las complicadas señales químicas que activan un potenciador.

Pero al usar este método, "puedes volverte loco rápidamente tratando de encontrar un potenciador", dijo Benjamin Gowen, un becario postdoctoral en el laboratorio de Corn en Berkeley y uno de los autores principales del estudio.

Un mejor enfoque sería un interruptor universal "encendido" que podría apuntar a cualquier parte del genoma y, si esa parte incluye un potenciador, podría activar ese potenciador. Afortunadamente, CRISPRa, desarrollado recientemente por Jonathan Weissmann, PhD, profesor de farmacología celular y molecular en UCSF y codirector del IGI, es una de esas herramientas. CRISPRa utiliza una versión "roma" de la proteína Cas9 que corta el ADN, atada a una cadena de proteínas activadoras. Aunque CRISPRa también usa la guía moléculas de ARN para apuntar a ubicaciones precisas en el genoma, en lugar de cortar el ADN, CRISPRa puede activar cualquier potenciador en el área.

Si bien las primeras aplicaciones de CRISPRa involucraron el uso de un ARN de guía única Para encontrar promotores, secuencias junto a los genes que ayudan a activarlos, el equipo de UCSF / Berkeley detrás del nuevo estudio se dio cuenta de que CRISPRa también podría ayudar a encontrar potenciadores. Al dirigir el complejo CRISPRa a miles de diferentes sitios potenciadores potenciales, razonaron, podrían determinar cuál tenía la capacidad de activar un gen en particular, incluso si ese gen estaba lejos del potenciador en el cromosoma.

"Esta es una forma fundamentalmente diferente de ver las secuencias reguladoras no codificantes", dijo Dimitre Simeonov, estudiante de doctorado en el laboratorio de Marson en UCSF y el otro autor principal del estudio.

Haciendo 20,000 experimentos a la vez

El gen que el equipo decidió estudiar produce una proteína llamada IL2RA, que es fundamental para la función de las células inmunitarias llamadas células T. Dependiendo de las condiciones del cuerpo, las células T tienen la capacidad de desencadenar la inflamación o suprimirla. El gen IL2RA produce una proteína que le dice a las células T que es hora de ponerse sus sombreros antiinflamatorios. Si los potenciadores que deberían activar el gen tienen errores, las células no logran suprimir la inflamación, lo que puede conducir a trastornos autoinmunes como la enfermedad de Crohn.

Para rastrear las ubicaciones de los potenciadores que controlan IL2RA, el equipo de UCSF y Berkeley produjeron más de 20,000 ARN guía diferentes y los colocaron en las células T con una proteína Cas9 modificada.

"Básicamente, realizamos 20,000 experimentos en paralelo para encontrar todas las secuencias que activan este gen", dijo Marson.

Efectivamente, apuntar a algunas de las secuencias con CRISPRa aumentó la producción de IL2RA, lo que arrojó una breve lista de ubicaciones que podrían ser importantes para regular el destino de las células T.

“Cada vez que tienes la oportunidad de hacer una pregunta de una manera totalmente nueva, de repente puedes descubrir cosas que te habrías perdido con métodos más antiguos”, dijo Gowen. "Encontramos estos potenciadores sin tener que suponer qué aspecto tenían".

Vincular los potenciadores mutantes a la enfermedad inflamatoria

Una de las posibles secuencias potenciadoras que identificó el equipo incluía el sitio de una variante genética común que ya se sabía que aumentaba el riesgo de EII, aunque no se entendía cómo lo hizo. Los equipos de Marson y Corn se preguntaron si esta variación genética podría alterar el interruptor que regula la cantidad de proteína IL2RA presente en las células T. Para probar esto, modificaron las células T de ratón para que contuvieran la variante genética asociada con la enfermedad humana, y encontraron que estas células T de hecho producían menos IL2RA.

"Esto comienza a desbloquear los circuitos fundamentales de la regulación de las células inmunitarias, lo que aumentará drásticamente nuestra comprensión de las enfermedades", dijo Marson.

A continuación, el equipo espera expandir el método, tal vez encontrando formas de buscar potenciadores de muchos genes diferentes a la vez, haciendo que la búsqueda de reguladores de trastornos inmunitarios sea mucho más rápida. Y esperan que el método sea una herramienta de amplia aplicación para desvincular las interacciones genéticas en todo tipo de células.

"Creemos que este será un método muy útil en general", dijo Corn. "Sería fácil para alguien interesado en las neuronas o cualquier otro tipo de célula detectarlo y buscar los potenciadores involucrados en la programación del comportamiento de esas células".