

El sistema CRISPR-Cas9 es un avance revolucionario en la edición del genoma, pero ¿cómo nos aseguramos de que nuestras tijeras moleculares sean seguras? Ahora, podemos buscar en el ADN para encontrar hasta el último corte.
El CRISPR-Cas9 edición del genoma cortes del sistema letra singular exactamente en la ubicación que los científicos especifican, pero a veces el Cas9 proteína corta el genoma, en otros lugares también, creando "fuera del objetivo efectos ". En trabajo publicado hoy en la revista Ciencias:, científicos del Innovative Genómica Institute, Gladstone Institutes y AstraZeneca revelan una nueva forma de identificar estos recortes no deseados. Cuando el ADN se rompe o se corta, las proteínas de reparación del ADN acuden al sitio. Los investigadores sacaron provecho de este fenómeno y crearon DISCOVER-Seq, un método que utiliza una proteína de reparación del ADN para identificar los sitios de corte Cas9.

Los efectos no deseados fuera del objetivo pueden ser inofensivos, pero tienen el potencial de afectar (SCD por sus siglas en inglés), funcionar, o incluso matar células dependiendo de dónde se produzcan. Para usar las proteínas CRISPR-Cas9 para tratar enfermedades humanas, los científicos necesitan saber cuáles son los efectos fuera del objetivo, para poder determinar si el tratamiento es seguro. Ésta es una tarea difícil. El ex director de biomedicina del IGI y actual profesor de biología del genoma en ETH Zurich, Jacob Corn, explica: “Finding CRISPR-Proteínas Cas fuera de los objetivos puede ser difícil. Los genomas son grandes y hay mucho espacio para buscar. Las cosas se ponen aún más difíciles cuando se habla de células de pacientes o modelos de ratones que se utilizan para probar posibles terapias de edición del genoma ".
Cuando Cas9 atraviesa un hebra de ADN para formar una ruptura de ADN, la célula recluta proteínas de reparación de ADN para reparar el daño. El maíz ha identificado previamente algunos jugadores clave en el proceso de reparación. Corn y los coautores Beeke Wienert y Stacia Wyman se preguntaron si sería posible usar proteínas reparadoras para identificar todos los lugares donde Cas9 y otros editores de Cas crean roturas de ADN, particularmente efectos fuera del objetivo.

Los investigadores consideraron varias proteínas reparadoras conocidas y encontraron que la proteína MRE11 es una de las primeras en llegar a los sitios de rotura del ADN. Marca el lugar como una X en un mapa del tesoro, indicando a otras proteínas reparadoras dónde ir a trabajar. Después de usar el sistema CRISPR-Cas9, los investigadores trataron la mezcla de células para congelar todo en su lugar, pegando efectivamente la proteína MRE11 al ADN para que permaneciera adherida a los sitios de corte de Cas9. A continuación, utilizaron anticuerpos para encontrar la proteína MRE11 y aislarla de la mezcla celular. Finalmente, secuenciaron el ADN pegado a la proteína MRE11, para identificar los sitios de corte CRISPR-Cas9. A este proceso lo llaman DISCOVER-Seq.
Antes de que los tratamientos CRISPR-Cas9 puedan usarse en la clínica, los investigadores deben probarlos ampliamente en animales y en células animales y humanas aisladas para asegurarse de que sean seguros y efectivos. Si bien existen otros sistemas para detectar objetivos fuera de objetivos, generalmente según las predicciones de la computadora o para encontrar sitios de corte después de que hayan sido reparados. Por lo general, estos sistemas funcionan mejor en un tipo de célula o modelo animal específico, y para algunos tipos de células, no hay formas confiables de encontrar objetivos no deseados. DISCOVER-seq es el primer método que puede encontrar directamente los sitios de corte de las herramientas de edición CRISPR en cualquier tejido vivo.
La proteína MRE11 es uno de los primeros jugadores en una vía clave de reparación del ADN y está presente en líneas celulares de mamíferos, ratones y humanos. Esto significa que se puede usar para encontrar sitios de corte de manera imparcial y se puede aplicar fácilmente en diferentes sistemas con los que anteriormente era difícil trabajar. “Ya existen algunos métodos muy buenos fuera del objetivo”, dice Corn, “pero funcionan mejor en sistemas altamente controlados, como células cultivadas en una placa de laboratorio. Una ventaja de DISCOVER-Seq es que teóricamente encuentra objetivos fuera de any sistema en el que funciona la edición del genoma ".
Debido a que MRE11 permite a los investigadores hacer zoom en un sitio de corte justo después de que se realiza el corte, los investigadores también están descubriendo cosas nuevas sobre cómo funciona la reparación del ADN. En última instancia, pueden utilizar este conocimiento para mejorar la edición del genoma CRISPR-Cas9.
Para poner esta nueva técnica a disposición de otros investigadores lo antes posible, Corn y sus colegas publicaron una versión preliminar del artículo en línea a través del repositorio de acceso abierto. bioRxiv, e hizo su protocolo y herramienta bioinformática disponible públicamente también. "DISCOVER-Seq ya es útil en el laboratorio", dice Corn, "y esperamos que algún día pueda usarse para encontrar objetivos fuera de lugar durante las terapias de edición del genoma".
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Este estudio fue publicado en la edición en línea de la revista. Ciencias: como "Detección imparcial de objetivos CRISPR fuera de objetivos in vivo utilizando DISCOVER-Seq. " Además de Corn, Wienert y Wyman, otros autores son Christopher D. Richardson, Charles D. Yeh, Pinar Akcakaya, Michelle J. Porritt, Michaela Morlock, Jonathan T. Vu, Katelynn R. Kazane, Hannah L. Watry, Luke M. Judge, Bruce R. Conklin y Marcello Maresca. Esta investigación fue financiada por la Fundación Li Ka Shing, el Instituto de Investigación Médica Heritage, el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre, los Institutos Gladstone, la Fundación de Investigación de la Anemia Fanconi, el Instituto de Medicina Regenerativa de California, la Asociación Australiana Estadounidense y el Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia.
El Innovative Genomics Institute (IGI) es una asociación académica sin fines de lucro entre UC Berkeley y UC San Francisco que apoya proyectos de investigación colaborativa en el Área de la Bahía. La misión del IGI es desarrollar e implementar la ingeniería del genoma para curar enfermedades, garantizar la seguridad alimentaria y mantener el medio ambiente para las generaciones actuales y futuras. Como pioneros en la edición del genoma, la genómica funcional y otras tecnologías de vanguardia, los científicos de IGI amplían continuamente los límites de la ciencia.
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