Descubriendo un paso oculto en CRISPR "Cortar y pegar"
IGI | Maya Kostman | 27 de julio de 2018
La reparación del ADN después del corte de CRISPR no es en absoluto lo que la gente pensaba
Noticias de Berkeley | Robert Sanders | 30 de julio de 2018
A pesar de las grandes esperanzas y la elevada inversión en CRISPR-Cas9 gen Edición, los científicos aún tienen mucho que aprender sobre cómo funciona en los humanos.
En el último ejemplo, la Universidad de California, Berkeley, los científicos encontraron que las suposiciones de la gente sobre cómo las células reparan el genoma, después de la Cas9 enzima recortes letra singular estan equivocados.
El descubrimiento proporciona una idea de por qué la edición genética CRISPR-Cas9 funciona notablemente bien en casi todos los (SCD por sus siglas en inglés), Se intentó, aunque no con el mismo éxito en todas las células. Y podría ayudar a los investigadores a aumentar la eficiencia con la que las células insertan nuevo ADN en el genoma para reemplazar un ADN dañino. crianza de organismos con mutación deseada con la secuencia de ADN correcta, por ejemplo, y generalmente modifique la edición CRISPR-Cas9 para obtener el resultado deseado.
“Si se quiere tratar la anemia falciforme, las posibilidades de éxito están inextricablemente ligadas a la eficiencia con la que se pueda sustituir el gen de la anemia falciforme mutado por el correcto”, afirmó Chris Richardson, investigador postdoctoral de la UC Berkeley y primer autor de un artículo que describe los hallazgos. “Si se extraen un millón de células de un paciente y se obtiene una tasa de inserción del 10 por ciento, no es tan bueno como si se obtiene del 30 al 40 por ciento. Poder manipular esas células para aumentar la frecuencia de este proceso, llamado reparación dirigida por homología, es emocionante”.
“La edición de genes es superpoderosa, prometedora pero, hasta ahora, mucha prueba y error. La forma en que funciona en las células humanas ha sido una caja negra con muchas suposiciones ”, dijo el autor principal Jacob Corn, profesor adjunto de biología molecular y celular de UC Berkeley. "Finalmente estamos empezando a tener una idea de lo que está pasando".
Corn, Richardson y sus colegas publicar sus hallazgos en el número de agosto de la revista Nature Genetics, que estará disponible en línea el 27 de julio.
Corn fue hasta hace poco el director científico de biomedicina en el Innovative Genómica Instituto, una entidad conjunta edición del Programa de investigación entre UC Berkeley y UC San Francisco. Este otoño se incorporará al cuerpo docente de ETH en Zúrich, Suiza.
CRISPR se basa en la reparación del ADN
La tecnología CRISPR-Cas9 es revolucionaria por la precisión con la que se dirige a una secuencia de ADN específica entre miles de millones de las que hay en el genoma y corta la molécula de ADN de doble cadena. Pero después, la reparación del daño depende de la célula.
La reparación puede ocurrir de dos maneras. Las enzimas pueden coser los extremos que cuelgan, lo que a menudo da como resultado que se agreguen o eliminen una o más bases, lo que altera la función del gen. Alternativamente, otras enzimas pueden reparar la rotura con un solo parche. hebra de ADN que coincide con la secuencia de ADN anterior y posterior al corte. complementario La hebra de ADN se crea para completar la reparación de la doble hebra.
El primero, llamado unión de extremos no homólogos, parece ser el resultado más común después del corte CRISPR. El segundo, la reparación dirigida por homología, ocurre con más frecuencia en algunos tipos de células que en otros y requiere la presencia de un fragmento de ADN que pueda usarse para reparar la rotura. Los investigadores a menudo proporcionan un fragmento de ADN monocatenario y esperan que la célula lo use para reemplazar la secuencia defectuosa con la nueva.
Sin embargo, ambos procesos son un poco misteriosos y nadie sabe por qué algunas células se insertan fácilmente en el ADN mientras que otras lo hacen con poca frecuencia.
“El entusiasmo por usar CRISPR-Cas9 para aplicaciones médicas o de biología sintética es grandioso, pero nadie sabe realmente qué sucede después de colocarlo en las células”, dijo Richardson. “Va y crea estas roturas y cuentas con las células para arreglarlas. Pero la gente realmente no entiende cómo funciona ese proceso ".
Para descubrir qué enzimas reparadoras de ADN son fundamentales para la reparación dirigida por homología después del corte CRISPR, Richardson y Corn emplearon una técnica llamada interferencia CRISPR (CRISPRi) para eliminar, uno a la vez, más de 2,000 genes que se sabe o se sospecha que están involucrados en la reparación del ADN, una función fundamental para una célula sana.
Sorprendentemente, muchos de los genes que demostraron ser importantes (la reparación dirigida por homología disminuyó drásticamente cuando se silenciaron) estaban involucrados en un sistema de reparación importante que no se cree que esté involucrado en la reparación CRISPR.
Anemia de Fanconi
La vía involucra 21 proteínas separadas y se llama vía de la anemia de Fanconi porque, si alguno de los genes de estas proteínas está dañado, las personas desarrollan anemia de Fanconi, una enfermedad hereditaria rara pero grave en la que la médula ósea no puede producir suficientes células sanguíneas nuevas. Está asociada con defectos de nacimiento y un alto riesgo de células cancerosas, incluida una probabilidad del 10 por ciento de desarrollar leucemia en la niñez. Pocos pacientes viven más allá de los 30 años.
La vía se ha conocido y estudiado durante décadas, pero se entendió en gran medida que repara un tipo específico de daño en el ADN: los enlaces cruzados entre cadenas de ADN, donde un nucleótido en una hebra de ADN se une estrechamente con un nucleótido de la hebra adyacente, lo que interfiere con la replicación del ADN y, a menudo, mata la célula. Los investigadores en la década de 1980 habían informado de una conexión entre la reparación dirigida por homología y la vía de la anemia de Fanconi, pero había sido ignorada o malinterpretada, anotó Corn.
“Basándonos en nuestro trabajo, creemos que la vía de la anemia de Fanconi también desempeña un papel importante en la reparación de otros tipos de lesiones, pero se entiende mejor como la vía que repara las roturas de doble cadena”, dijo Richardson. “Después de la edición de Cas9, la vía de la anemia de Fanconi es necesaria si se desea insertar ADN nuevo”.
Sin embargo, la importancia de la vía de la anemia de Fanconi en la reparación de roturas CRISPR pone en duda algunos tratamientos CRISPR planificados para la enfermedad en sí. Sin una vía de anemia de Fanconi activa, es posible que las células no puedan reemplazar sus genes mutados con genes normales después de que Cas9 haga un corte.
De hecho, el nivel de actividad de la vía de la anemia de Fanconi puede afectar la eficiencia con la que CRISPR puede insertar ADN en una célula específica. Los investigadores concluyeron que, si bien la unión de los extremos es el mecanismo de reparación predeterminado después de una rotura de doble hebra, la vía de la anemia de Fanconi compite con ella, y que una mayor actividad da como resultado una reparación más dirigida por homología y una menor unión de los extremos.
Tratamientos contra el cáncer
Si bien los hallazgos ayudan a los científicos a comprender mejor los mecanismos de reparación del ADN en las células humanas, también podrían ayudar a los investigadores a desarrollar terapias contra el cáncer que se dirijan a la reparación del ADN en las células cancerosas. Debido a que ahora parecen estar involucrados otros factores en la reparación de roturas de doble hebra, esta investigación amplía la lista de proteínas que podrían estar mal reguladas para estropear la reparación del ADN en las células cancerosas y hacerlas más susceptibles a la muerte.
Richardson también descubrió que una de las 21 proteínas en la vía, FANCD2, siempre se aloja en el sitio de la ruptura de la doble hebra creada por CRISPR-Cas9, lo que indica que desempeña un papel importante en la regulación de la inserción de nuevo ADN en el genoma en el sitio del corte. FANCD2 podría modificarse para aumentar la frecuencia con la que una célula inserta ADN a través de la reparación dirigida por homología.
“Además, dado que FANCD2 se localiza en el sitio de las roturas de Cas9, se puede utilizar FANCD2 para mapear dónde está cortando Cas9 en cualquier tipo de célula”, dijo Richardson. “Si editas una población de células y quieres saber dónde están los cortes dentro y fuera del objetivo, puedes simplemente mapear dónde se encontró FANCD2 en el genoma y podrás encontrar los cortes”.
“Toda la vía de la anemia de Fanconi afecta el equilibrio entre la unión de los extremos y la reparación dirigida por homología; actúa como un policía de tráfico ”, dijo Corn. "Por lo tanto, el genotipo de un paciente afectará la forma en que se realiza la edición de genes".
Otros autores de UC Berkeley son Katelynn Kazane, Sharon Feng, Elena Zelin, Nicholas Bray, Axel Schäfer y Stephen Floor, quien ahora está en UCSF. El trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Li Ka Shing, el Instituto de Investigación Médica Heritage y la Fundación de Investigación de la Anemia Fanconi.
