Esta publicación es la primera de una serie nueva y en curso: cuáles son los grandes desafíos para CRISPRbasadas en tecnologías, ¿qué progreso hemos logrado hasta ahora y qué podemos esperar en el futuro cercano? Seguiré publicando en esta serie de forma irregular, así que estad atentos a tu tema favorito. Estas publicaciones no están destinadas a menospreciar ninguno de los increíbles avances realizados hasta ahora en estos diversos subcampos, sino a mirar hacia adelante a todas las cosas buenas en el horizonte. Estoy seguro de que estos temas están al frente y al centro de la mente de las personas que trabajan en estos campos, y esta serie de publicaciones tiene como objetivo acercar a los lectores ocasionales a lo que va a estar de moda.
Primero están las imágenes CRISPR, en las que Proteínas Cas proteínas se utilizan para visualizar algunos celulares componente en células fijas o vivas. Ésta es un área tremendamente emocionante. Las tecnologías 3C / 4C / Hi-C / XYZ-C brindan una gran comprensión de la proximidad de dos loci promediados en un gran número de celdas en un momento determinado. Pero, ¿qué sucede en cada celda individual? ¿O en tiempo real? Ya sabemos que la ubicación importa, pero solo estamos rascando la superficie sobre qué, cuándo, cómo o por qué.
Las imágenes CRISPR comenzaron cuando Stanley Qi y Bo Huang fusionaron GFP con dCas9 catalíticamente inactivado mirar los telómeros en las células vivas. Desde entonces, hemos visto enfoques similares (proteínas o tintes fluorescentes llevados a una región a través de Cas9) y mucha creatividad solía multiplex hasta tres colores. Hay mucho más por ahí, pero quiero centrarme en el futuro ...
¿Cuál es el mayor desafío para las imágenes CRISPR de células vivas en el futuro cercano?
Sensibilidad
La mayoría de las técnicas de imágenes CRISPR tienen problemas con la relación señal-ruido. Hasta ahora no es posible ver un Cas9 fluorescente uniendo un locus de copia única cuando hay tantas moléculas Cas9 flotando alrededor del núcleo. Hasta ahora, las imágenes han dejado de lado la señal al ruido, ya sea apuntando a secuencias repetidas (colocando múltiples Cas9 fluorescentes en un lugar) o reclutando múltiples fluoróforos en un Cas9. Incluso entonces, la mayoría de los sistemas de imágenes CRISPR se basan en fugas expresión de promotores inducibles no inducidos para mantener el número de copias de Cas9 a la par con los loci repetitivos. Se han realizado imágenes de una sola molécula de Halo-Cas9 en células vivas, pero nuevamente solo en repeticiones. Incluso Las imágenes de células fijas tienen problemas con loci no repetitivos.. La sensibilidad también es un problema para las imágenes RCas9 - esta innovación permitió a los investigadores usar Cas9 dirigido a ARN específicos para seguir las transcripciones en células vivas. Pero se exploró principalmente con alta expresión (por ejemplo, GAPDH) o altamente concentrada (por ejemplo, gránulos de tensión) ARNs guía. ¿Cómo podemos rastrear un locus de copia única, o idealmente múltiples loci simultáneamente, para ver cómo cambia la organización nuclear con el tiempo?
Alguien va a resolver el problema de la sensibilidad, permitiendo que la gente vea genómico loci en células vivas en tiempo real. ¿Aprenderemos cómo las variantes intergénicas alteran la organización nuclear para inducir enfermedades? ¿Veremos ARN no codificantes interactuando con ARNm diana durante el desarrollo? Con aplicaciones tan grandes, sé que mucha gente está trabajando en el problema y estoy seguro de que pronto habrá grandes avances.
