Cómo hacer un ARN guía para un Knockout Cas9

ARN guía la tradición se divide en varios periódicos, personas y lugares, y con frecuencia me preguntan cuál es la "mejor" manera de hacer una guía moléculas de ARN para Cas9. El siguiente es el estado del arte tal como yo lo entiendo, a partir de hoy (8/11/14), dividido en varios pasos. Los pasos a continuación asumen que desea utilizar Streptococcus pyogenes Cas9 para cortar un gen para introducir una inserción / eliminación ("indel”) Para hacer un knockout (el caso de uso más simple) usando un doblehebra corte (tipo salvaje Cas9). El proceso puede diferir si desea (por ejemplo) utilizar CRISPRi Inhibir transcripción. He usado * para marcar pasos que serían al menos algo alterados para otras aplicaciones o si está usando partes menos comunes (por ejemplo, Cas9 de otra especie, promotor de ARN guía diferente, etc.).   Antes de que empieces

1. Decida qué tipo de orientación desea realizar. Aquí estamos considerando el corte de doble hebra para hacer un golpe de gracia mediante la introducción de un indel.
2. Decide qué Cas9 usarás. Aquí, asumiremos que estás usando Streptococcus pyogenes (también conocido como "Espía“). Esta elección afectaría al motivo adyacente protospacer ("PAM") que buscará. *
3. Obten lo genómico secuencia desde la que desea apuntar Gen NCBI o en cualquier otro lugar (por ejemplo, si se dirige a una región intergénica). *
4. Para los nocauts, generalmente desea introducir un indel lo más cerca posible del extremo 5 'de la región de codificación. Esto tendrá la mayor probabilidad de crear un proteína-destruir el desplazamiento de fotogramas. *

Encontrar guías

1. Utilice uno de los muchos servidores para encontrar ARN guía en la región que le gustaría cortar. Por ejemplo, CRISPR-MIT, E-CRISPo CHOPCHOP. La herramienta que elija es principalmente una preferencia personal, y cada una tiene su propio modelo para calificar los ARN guía.
2. Cada sitio de destino será ~ 23 bases terminando en "GG"(La guía une la hebra Crick) o ~ 23 bases comenzando en"CC”(La guía une la hebra de Watson). El motivo adyacente del protoespaciador ("PAM") se refiere a esas últimas o primeras tres bases y está presente en el ADN estás apuntando pero deberías no ser utilizado en la guía de ARN. Por lo tanto, el ARN guía en sí será de ~ 20 bases y carecerá de PAM. SpyCas9 también puede usar "AG"(Watson"CT“) Como PAM, pero no tan eficientemente.
3. La longitud exacta de la guía no parece importar mucho; cualquier cosa de 17 a 27 bases (recuerde, las guías no incluyen el PAM) parece básicamente bien (con algunos calificadores).

Elegir una guía Ahora tiene una lista (posiblemente muy larga) de guías potenciales. Cada uno tiene una puntuación asociada. ¿Cómo eliges cuál usar? Aquí hay una lista semiordenada de factores a considerar, desde el más importante hasta el menos importante. Considere estos puntajes cualitativos, en lugar de cuantitativos.

1. Para un knockout, no importa a qué hebra se une el ARN guía, pero CRISPRi las guías deben ser complementario a la hebra no codificante. *
2. Las guías deben ser perfectamente complementarias a la región a la que desea apuntar en las 8-12 bases más cercanas al PAM.
3. Nunca elija una guía que tenga alguna fuera del objetivo sitios (coincidencia perfecta para las 8-12 bases más cercanas a la PAM) en una codificación del genoma.
4. Nunca use una guía con> = 3 U seguidas, ya que estas secuencias actúan como terminadores Pol III. Obviamente, esto no es aplicable si está utilizando un vector Pol II en lugar de los vectores promotores U6 comunes. *
5. Preferir guías con un PAM de NGG en lugar de NAG.*
6. Evite secuencias con estructura secundaria significativa (La Servidor web de Viena es un gran lugar para comprobar esto). También debe evitar las guías que interrumpen la estructura secundaria de la región constante 3 ′ (la secuencia de región constante más común es "GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU").
7. Contenido de GC debe estar entre ~ 30-80%, cuanto más alto, mejor (¡pero no demasiado alto!).
8. Evite adicionales Ges después del PAM. Por ejemplo, una secuencia genómica de "|AGG|CCAT"Probablemente esté bien (donde"AGG”Es el PAM). Pero "|AGG|GCAT"Probablemente no sea una buena idea, y"|AGG|GGGG”Es definitivamente un no-no. *
9. Algunos grupos han demostrado que Uestán desfavorecidos en la posición -1, -2 y -4 (contando desde el primer bases de la región constante). Otros grupos no han visto esto. Su experiencia puede ser diferente.
10. Prefiera guías en regiones hipersensibles a la DNAsa (como lo anota ENCODE en el Navegador de genoma UCSC). Esto no es una necesidad, pero probablemente no hará daño.
11. Han pasado recientemente mostrado que la microhomología en el sitio de corte puede aumentar sustancialmente la posibilidad de obtener una indel fuera de marco. Esto no afecta el corte en sí, pero podría ayudarte a conseguir el nocaut.

Construcción de la guía final

1. Tome la secuencia de guía que eligió anteriormente y agregue la secuencia constante "GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU”Hasta el extremo 3 ′.
2. Si su guía no comienza con un 5 ′ G, solo agregue uno. Esto aumenta la eficiencia de la transcripción del promotor U6 y no necesita ser homólogo a la región a la que se dirige. *
3. Agregue sitios de clonación apropiados para el expresión vector que ha elegido. Por ejemplo, si usa el laboratorio de Zhang pX330 vector, añadir "CACC"Hasta el extremo 5 ′ de la cadena Watson y"AAAC”Hasta el extremo 5 ′ de la hebra Crick. *
4. Ordenar oligonucleótidos, templar y ligar.

Lo anterior puede parecer mucho, pero en realidad no es tan malo. Rápidamente obtendrá una idea de lo que hace que los guías sean buenos o malos. Dado que es tan fácil probar múltiples guías, siempre recomiendo hacer al menos dos guías por nocaut que le gustaría hacer. De esa manera, si uno es un fiasco, no te pillarán desprevenidos. Obviamente, hay muchos * s en la lista anterior, que indican pasos que pueden ser un poco diferentes si su aplicación o partes difieren de EspíaCas9 haciendo un ruptura de doble hebra a los efectos de un nocaut. La caja de herramientas siempre se está expandiendo, ¡así que abundan las opciones! Pero es de esperar que lo anterior proporcione una idea general de cómo empezar. ¿Tienes otro buen truco para compartir? ¿Me perdí algo importante? ¿Quieres exponer la mejor manera de hacer una guía CRISPRi (otra bola de cera)? ¡Siéntete libre de dejar un comentario!

By maíz jacob

Jacob Corn es profesor de biología del genoma en ETH Zürich. El laboratorio de maíz estudia la intersección de la reparación del ADN humano y las herramientas de edición del genoma y desarrolla nuevos enfoques para curar enfermedades humanas mediante la edición del genoma.