Aventuras en la preparación de bibliotecas CRISPR

Durante los últimos meses, algunos de nosotros en el IGI hemos estado generando nuevos ARNsg bibliotecas para CRISPRi y CRISPRa. Después de raspar las colonias de casi un centenar de placas extragrandes de LB-Agar, llegó el momento de llenar el laboratorio con el dulce olor a lisado bacterias fotosintéticas y ADN tampones de preparación. Estábamos trabajando con 21 subbibliotecas independientes, con un total de alrededor de 250,000 sgRNA. Plásmido La preparación en esta escala es una bestia completamente diferente a todo lo que había hecho antes, así que decidimos compartir algunas ideas sobre lo que funciona (¡y lo que no!) para preparar bibliotecas de sgRNA de manera eficiente.

Preparando la estación de trabajo

Nos preocupaba que otros plásmidos se infiltraran en nuestras preparaciones, especialmente plásmidos individuales de ARNg que se utilizan con frecuencia en nuestro laboratorio. Rociamos y fregamos nuestros bancos y el colector de vacío con etanol al 70% y RNase-Away antes de comenzar, y algunas veces durante el día. Con suerte, esto debería destruir o desnaturalizar los plásmidos perdidos que se encuentren por ahí. También vale la pena limpiar la trampa de la aspiradora y colocar filtros nuevos en la línea de aspiración, ya que los filtros viejos y sucios pueden debilitar la potencia de la aspiradora.

Haz toda la preparación de ADN a la vez

Para mí, es mucho más eficiente dedicar un par de días exclusivamente a la preparación de ADN de alto rendimiento que distribuir el trabajo durante varios días, unas pocas columnas a la vez.

Trabajo en equipo.

Los pasos iniciales de lisis y neutralización en la mayoría de las preparaciones de plásmidos son sensibles al tiempo, por lo que existe un límite en la cantidad de muestras que una persona puede procesar a la vez. Descubrimos que un equipo de 3 personas (cada una procesando 8 muestras a la vez) maximizaba nuestro rendimiento sin que nos encontráramos demasiado. Después de eluir el ADN de las columnas, una persona puede gestionar la precipitación del ADN mientras que otros comienzan con la siguiente ronda de muestras.

Material de partida

El raspado de las colonias de una placa de agar LB de 23 x 23 cm nos dio una masa de sedimento bacteriano promedio de 1.1 g (rango 0.5-1.6 g). Esto significaba que cada placa de errores tenía su propia columna maxiprep (consulte las recomendaciones del kit a continuación). Si está trabajando con insectos de cultivo líquido u otros tamaños de placa, puede agrupar o dividir en alícuotas las muestras para obtener una masa de sedimento similar por columna.

Kits de preparación de plásmidos

Terminamos probando varios kits de preparación de plásmidos diferentes, y el claro ganador en nuestras manos fue el Kit Sigma GenElute HP Plasmid Maxiprep. Las columnas son compatibles con el colector de vacío de 24 puertos QIAGEN que ya teníamos en el laboratorio, el protocolo era apto para realizar 24 preparaciones en un lote y el sistema de vacío de la casa en nuestro edificio era lo suficientemente fuerte como para extraer líquido a través de las 24 columnas en una vez. Es importante destacar que todas las columnas se ejecutaron de forma coherente y razonablemente rápida. Una columna lenta o obstruida es un problema molesto pero que se puede resolver cuando se hacen 4 o 5 preparaciones, pero realmente puede respaldar el proceso cuando se hacen varios lotes de 24. Nuestro rendimiento promedio de este kit fue de 1.4 mg por preparación.

Kits para evitar:

• Sigma GenElute HP Plasmid Megaprep: Sigma anuncia 4 veces el rendimiento de una columna de megaprep en comparación con sus maxipreps. Algunas de nuestras muestras podrían agruparse, por lo que pensamos que agrupar 4 muestras en un megaprep sería más rápido que ejecutarlas como 4 maxipreps individuales. ¡Chico, estábamos equivocados! Los megapreps tuvieron que procesarse uno o dos a la vez y, por lo tanto, no escalaron bien en absoluto. Lo peor de todo es que las columnas megaprep NO eran compatibles con el colector de vacío de QIAGEN. Logramos arreglar esto con tubos y adaptadores, pero el sistema de vacío de la casa solo era lo suficientemente fuerte como para tirar de una o dos de las columnas megaprep más grandes a la vez. Para nosotros, las megapreparaciones tomaron mucho más tiempo y dieron aproximadamente la mitad del rendimiento que hubiéramos esperado con solo moler 4 veces más maxipreps.
• QIAGEN Plasmid Plus Maxiprep Kit: 1 de las 8 columnas que usamos se estancó mientras se ejecutaba el lisado aclarado. Esa columna tuvo que dejarse en el vacío durante la noche. Nuestros rendimientos también fueron inferiores a los de Sigma maxipreps.
• Kit QIAGEN HiSpeed ​​Plasmid Maxiprep: estos no escalan bien en absoluto. Las columnas no son compatibles con un colector de vacío y los filtros de jeringa QIAprecipitator requieren muchas manipulaciones para cada muestra individual. Después de las primeras 4 muestras, abandoné por completo el paso del precipitador QIA. Precipitar el ADN con un giro de 45 minutos fue mucho más rápido cuando se trataba de 10 o 20 preparaciones a la vez.

Siempre estamos interesados ​​en formas de hacer que la próxima preparación de la biblioteca de sgRNA sea más fácil que la anterior. Si tiene su propio kit de preparación de plásmidos favorito u otros trucos para una preparación eficiente de la biblioteca, no dude en dejar un comentario.

Un agradecimiento especial a los demás miembros del equipo de preparación de ADN: Gemma Curie, Amos Liang y Emily Lingeman. ¡Todavía estaría ejecutando maxipreps si no fuera por ellos!

By benjamin gowen