Investigadores de IGI mejoran la eficiencia del reemplazo de genes

Advance mejora el corte y el pegado con la edición de genes CRISPR-Cas9
Noticias de Berkeley | Robert Sanders | 20 de enero de 2016

Los investigadores de UC Berkeley han logrado una mejora importante en CRISPR-Cas9 tecnología que alcanza una tasa de éxito sin precedentes del 60 por ciento al reemplazar un tramo corto de letra singular con otro.

La técnica mejorada es especialmente útil cuando se intenta reparar la genética. mutaciones que causan enfermedades hereditarias, como la hoz (SCD por sus siglas en inglés), enfermedad o inmunodeficiencia combinada grave. La técnica permite a los investigadores parchear una sección anormal de ADN con la secuencia normal y potencialmente corregir el defecto y ya está trabajando en cultivo celular para mejorar los esfuerzos en curso para reparar el defecto. los genes.

Cas9 se une al ADN: una vista del Cas9 proteína (rojo y azul) unido a un doble hebra de ADN (violeta y gris). Después de que se cortan ambas hebras, una hebra de ADN (puntos morados) queda libre y puede unirse con un trozo de ADN que se inserta en la rotura. Este comportamiento puede utilizarse para aumentar significativamente la eficiencia de edición de genes. (Imagen de Christopher Richardson, UC Berkeley, basada en la estructura resuelta por el laboratorio de Martin Jinek).

“Lo emocionante de CRISPR-Cas9 es la promesa de fijar genes en su lugar en nuestro genoma,, pero la eficiencia para eso puede ser muy baja ”, dijo Jacob Corn, director científico de Innovative Genómica Iniciativa en UC Berkeley, un grupo que se enfoca en la edición del genoma de próxima generación y la regulación de genes para aplicaciones clínicas y de laboratorio. "Si piensa en la edición de genes como un procesador de texto, sabemos cómo cortar, pero necesitamos una forma más eficiente de pegar y pegar una nueva pieza de ADN donde hacemos el corte".

“En los casos en los que desee cambiar regiones muy pequeñas de ADN, hasta 30 pares de bases, esta técnica sería extremadamente eficaz ”, dijo el primer autor Christopher Richardson, un postdoctorado de IGI.

Problemas en secciones cortas de ADN, incluidas las simples. bases-Las mutaciones de pares son típicas de muchas enfermedades genéticas. Los pares de bases son los bloques de construcción individuales del ADN, unidos de extremo a extremo en una hebra que se enrolla alrededor de un complementario hebra para hacer la bien conocida molécula de ADN helicoidal de doble hebra.

Richardson, Corn y sus colegas de IGI describen la nueva técnica en la edición del 21 de enero de la revista Nature Biotechnology.

Agarrando un mechón suelto

Richardson inventó el nuevo enfoque después de descubrir que la proteína Cas9, que realiza el corte real del ADN, permanece adherida al cromosoma por hasta seis horas, mucho después de haber cortado el ADN de doble hebra. Richardson observó de cerca la proteína Cas9 unida a las dos hebras de ADN y descubrió que mientras la proteína cuelga de tres de los extremos cortados, uno de los extremos permanece libre.

Jennifer Doudna explica cómo CRISPR-Cas9 edita genes. (Video de Roxanne Makasdjian y Stephen McNally, UC Berkeley.)

Cuando Cas9 corta el ADN, los sistemas de reparación en la célula pueden tomar un fragmento de ADN complementario, llamado plantilla, para reparar el corte. Los investigadores pueden agregar plantillas que contengan cambios que alteren las secuencias existentes en el genoma, por ejemplo, corrigiendo una mutación que causa una enfermedad.

Richardson razonó que llevar la plantilla sustituta directamente al sitio del corte mejoraría la eficiencia del parcheo y construyó un fragmento de ADN que coincide con el extremo del ADN libre y lleva la secuencia genética que se insertará en el otro extremo. La técnica funcionó muy bien, permitiendo la reparación exitosa de una mutación con hasta un 60 por ciento de eficiencia.

“Nuestros datos indican que las roturas de Cas9 podrían ser diferentes a nivel molecular de las roturas generadas por otras nucleasas, Tales como TALENS y nucleasas de dedos de zinc, lo que sugiere que estrategias como las que estamos usando pueden brindarle una reparación más eficiente de las roturas Cas9 ”, dijo Richardson.

Los investigadores también demostraron que las variantes de la proteína Cas9 que se unen al ADN pero no cortan también pueden pegar con éxito una nueva secuencia de ADN en el sitio de unión, posiblemente formando una estructura de "burbuja" en el ADN objetivo que también actúa para atraer la plantilla de reparación. . La edición de genes utilizando Cas9 sin cortar el genoma podría ser más segura que la edición de genes típica al eliminar el peligro de fuera del objetivo cortando el genoma, dijo Corn.

Los coautores con Richardson y Corn son los investigadores del IGI Jordan Ray, Mark DeWitt y Gemma Curie. El trabajo fue financiado por la Fundación Li Ka Shing.

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Mejora de la edición del genoma dirigida por homología mediante CRISPR-Cas9 catalíticamente activo e inactivo utilizando ADN de donante asimétrico
Biotecnología de la naturaleza | CD Richardson, GJ Ray, MA DeWitt, GL Curie y JE Corn | 20 de enero de 2016