El avance de la ingeniería de células T evita la necesidad de virus en la edición del genoma

IGI | Maya Kostman | 11 de julio de 2018

El avance de la ingeniería de células T evita la necesidad de virus en la edición de genes
Centro de noticias de UCSF | Pete Farley | 11 de julio de 2018

Con una técnica más rápida, más barata y más precisa, los autores dicen que está 'listo para las carreras' hacia lo nuevo Celular Terapias

En un logro que tiene implicaciones significativas para la investigación, la medicina y la industria, los científicos de UC San Francisco han reprogramado genéticamente las células inmunes humanas conocidas como las células T sin uso virus para insertar ADN. Los investigadores dijeron que esperan su técnica: un enfoque rápido, versátil y económico que emplea CRISPR gen-tecnología de edición - para ser ampliamente adoptada en el floreciente campo de la terapia celular, acelerando el desarrollo de tratamientos nuevos y más seguros para células cancerosas, autoinmunidad y otras enfermedades, incluidos los trastornos hereditarios raros.

El nuevo método descrito en el 11 de Julio de 2018 tema de la Naturaleza, ofrece un robusto sistema molecular de "cortar y pegar" para reescribir genoma, secuencias en células T humanas. Se basa en la electroporación, un proceso en el que se aplica un campo eléctrico a las células para hacer que sus membranas sean temporalmente más permeables. Después de experimentar con miles de variables en el transcurso de un año, los investigadores de UCSF encontraron que cuando ciertas cantidades de células T, ADN y las "tijeras" CRISPR se mezclan y luego se exponen a un campo eléctrico apropiado, las células T tomarán en estos elementos e integran secuencias genéticas específicas precisamente en el sitio de un corte programado por CRISPR en el genoma.

"Este es un método rápido y flexible que se puede utilizar para alterar, mejorar y reprogramar las células T para que podamos darles la especificidad que queremos para destruir el cáncer, reconocer infecciones o reducir la respuesta inmune excesiva que se observa en las enfermedades autoinmunes". dijo UCSF alex marson, MD, PhD, profesor asociado de microbiología e inmunología, miembro de la UCSF Helen Diller Family Comprehensive Cancer Centery autor principal del nuevo estudio. "Ahora nos vamos a las carreras en todos estos frentes".

Pero tan importante como la velocidad y la facilidad de uso de la nueva técnica, dijo Marson, también director científico de biomedicina en Innovative Genómica Institute, es que el enfoque hace posible insertar tramos sustanciales de ADN en las células T, lo que puede dotar a las células de nuevas y poderosas propiedades. Los miembros del laboratorio de Marson han tenido cierto éxito usando electroporación y CRISPR insertar fragmentos de material genético en las células T, pero hasta ahora, numerosos intentos de muchos investigadores de colocar largas secuencias de ADN en las células T habían provocado la muerte de las células, lo que llevó a la mayoría a creer que las secuencias de ADN grandes son excesivamente tóxicas para las células T.

Para demostrar la versatilidad y el poder del nuevo método, los investigadores lo utilizaron para reparar una enfermedad genética crianza de organismos con mutación deseada en células T de niños con una forma genética rara de autoinmunidad, y también creó células T personalizadas para buscar y matar células de melanoma humano.

Los virus causan infecciones al inyectar su propio material genético a través de las membranas celulares, y desde la década de 1970 los científicos han explotado esta capacidad, despojando a los virus de características infecciosas y utilizando los "vectores virales" resultantes para transportar ADN a las células para la investigación. terapias de genes, y en un ejemplo reciente muy publicitado, para crear las células CAR-T utilizadas en la inmunoterapia del cáncer.

Las células T diseñadas con virus ahora están aprobadas por la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. Para combatir ciertos tipos de leucemia y linfoma. Pero la creación de vectores virales es un proceso laborioso y costoso, y la escasez de vectores de grado clínico ha provocado un cuello de botella en la fabricación tanto de las terapias génicas como de las basadas en células. Incluso cuando están disponibles, los vectores virales están lejos de ser ideales, porque insertan genes al azar en los genomas celulares, lo que puede dañar genes sanos existentes o dejar genes recién introducidos sin el control de los mecanismos reguladores que aseguran que las células funcionen normalmente. Estas limitaciones, que podrían conducir potencialmente a efectos secundarios graves, han sido motivo de preocupación tanto en la terapia génica como en las terapias celulares, como la inmunoterapia basada en CAR-T.

"Ha habido treinta años de trabajo tratando de introducir nuevos genes en las células T", dijo el primer autor Theo Roth, estudiante de doctorado y doctorado en UCSF. Programa de entrenamiento científico médico quien diseñó y dirigió el nuevo estudio en el laboratorio de Marson. “Ahora ya no debería ser necesario tener seis o siete personas en un laboratorio trabajando con virus solo para diseñar células T, y si comenzamos a ver cientos de laboratorios que diseñan estas células en lugar de solo unas pocas, y trabajan con cada vez más secuencias de ADN complejas, probaremos muchas más posibilidades que acelerará significativamente el desarrollo de futuras generaciones de terapia celular ". 

Después de casi un año de prueba y error, Roth determinó las proporciones de las poblaciones de células T, la cantidad de ADN y la abundancia de CRISPR que, combinadas con un campo eléctrico entregado con los parámetros adecuados, darían como resultado una edición eficiente y precisa de las células T 'genomas.

Para validar estos hallazgos, Roth ordenó a CRISPR que etiquetara una matriz de diferentes células T proteínas con proteína verde fluorescente (GFP), y el resultado fue muy específico, con niveles muy bajos de "fuera del objetivo”Efectos: cada estructura subcelular CRISPR-Cas9 Las plantillas habían sido diseñadas para etiquetar con GFP, y no con otras, brillaban en verde bajo el microscopio.

Entonces, en complementario En experimentos ideados para servir como prueba de principio de la promesa terapéutica de la nueva técnica, Roth, Marson y sus colegas mostraron cómo podría usarse potencialmente para preparar las células T contra enfermedades autoinmunes o cáncer.

En el primer ejemplo, Roth y sus colegas utilizaron células T proporcionadas al laboratorio de Marson por el Dr. Kevan Herold de la Facultad de Medicina de Yale. Las células procedían de tres hermanos con una enfermedad autoinmune grave y poco común que hasta ahora ha sido resistente al tratamiento. La secuenciación genómica había demostrado que las células T de estos niños portan mutaciones en un gen llamado IL2RA. Este gen contiene instrucciones para un receptor de la superficie celular esencial para el desarrollo de células T reguladoras, o Tregs, que mantienen a raya a otras células inmunitarias y previenen la autoinmunidad.

Con la técnica CRISPR no viral, el equipo de UCSF pudo reparar rápidamente el IL2RA defecto en las células T de los niños y para restaurar las señales celulares que habían sido dañadas por las mutaciones. En la terapia CAR-T, las células T que se han eliminado del cuerpo se diseñan para mejorar su capacidad de combatir el cáncer y luego se devuelven al cuerpo para atacar los tumores. Los investigadores esperan que un enfoque similar pueda ser eficaz para el tratamiento de enfermedades autoinmunes en las que las Tregs funcionan mal, como la observada en los tres niños con la IL2RA mutaciones.

En un segundo conjunto de experimentos realizados en colaboración con Cristina Puig-Saus, PhD, y Antoni Ribas, MD, del Parker Institute for Cancer Immunotherapy en UCLA, los científicos reemplazaron completamente los receptores de células T nativas en una población de células T humanas normales con nuevos receptores que habían sido diseñados específicamente para buscar un subtipo particular de células de melanoma humano. Los receptores de células T son los sensores que usan las células para detectar enfermedades o infecciones, y en las placas de laboratorio, las células diseñadas se concentran de manera eficiente en las células de melanoma objetivo mientras ignoran otras células, exhibiendo el tipo de especificidad que es un objetivo principal de la medicina de precisión contra el cáncer.

Sin usar virus, los investigadores pudieron generar una gran cantidad de células modificadas por CRISPR reprogramadas para mostrar el nuevo receptor de células T. Cuando se transfirieron a ratones implantados con tumores de melanoma humano, las células T humanas modificadas fueron al sitio del tumor y mostraron actividad anticancerígena.

"Esta estrategia de reemplazar el receptor de células T puede generalizarse a cualquier receptor de células T", dijo Marson, también miembro de la Instituto Parker de Inmunoterapia contra el Cáncer en UCSF y un investigador de Chan Zuckerberg Biohub. "Con esta nueva técnica podemos cortar y pegar en un lugar específico, reescribiendo una página específica en la secuencia del genoma".

Roth dijo que debido a que la nueva técnica hace posible crear líneas de células T personalizadas viables en poco más de una semana, ya ha transformado el entorno de investigación en el laboratorio de Marson. Las ideas para experimentos que anteriormente se consideraban demasiado difíciles o costosos debido a los obstáculos que presentaban los vectores virales ahora están maduras para la investigación. "Trabajaremos en 20 ideas 'locas'", dijo Roth, "porque podemos crear plantillas CRISPR muy rápidamente, y tan pronto como tengamos una plantilla, podemos introducirla en las células T y hacerlas crecer rápidamente".

Marson atribuye el éxito del nuevo método a la “perseverancia absoluta” de Roth frente a las creencias generalizadas de que los vectores virales eran necesarios y que las células T solo podían tolerar pequeñas piezas de ADN. “Theo estaba convencido de que si podíamos encontrar las condiciones adecuadas podríamos superar estas limitaciones percibidas, y realizó un esfuerzo hercúleo para probar miles de condiciones diferentes: la relación entre CRISPR y el ADN; diferentes formas de cultivar las células; diferentes corrientes eléctricas. Al optimizar cada uno de estos parámetros y reunir las mejores condiciones, pudo ver este asombroso resultado ".

Además de los investigadores de la UCSF, la Facultad de Medicina de Yale y la UCLA, el trabajo se llevó a cabo en colaboración con científicos del Instituto Nacional del Cáncer en Frederick, Maryland; Universidad Stanford; la Universidad de Chicago; Takara Bio; el Biohub de Chan Zuckerberg; la Universidad de Nebraska; el Hospital de Niños de Filadelfia; y la Universidad de Pennsylvania.

Consulte el estudio publicado en línea para obtener una lista completa de autores, así como información sobre financiación. Marson es cofundador de Spotlight Therapeutics y se desempeña como asesor de Juno Therapeutics y PACT Pharma. El laboratorio de Marson ha recibido financiación patrocinada por Juno, Epinomics y Sanofi, así como un obsequio de Gilead Sciences. Roth, Puig-Saus, Eric Shifrut, PhD, Ribas y Marson son inventores de nuevas solicitudes de patentes relacionadas con esta investigación.