Las pruebas rápidas y frecuentes para COVID-19 son fundamentales para controlar la propagación de los brotes, especialmente a medida que surgen nuevas variantes más transmisibles.
Mientras que la prueba de diagnóstico COVID-19 estándar de oro de hoy, que utiliza qRT-PCR, reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (PCR), es extremadamente sensible y detecta hasta una copia de moléculas de ARN por microlitro, requiere equipo especializado, un tiempo de ejecución de varias horas y un laboratorio centralizado. Como resultado, las pruebas suelen tardar al menos uno o dos días.
Un equipo de investigación dirigido por científicos de los laboratorios de Jennifer Doudna, David Savage y Patrick Hsu en la Universidad de California, Berkeley, tiene como objetivo desarrollar una prueba de diagnóstico que sea mucho más rápida y fácil de implementar que la qRT-PCR. Ahora ha combinado dos tipos diferentes de CRISPR enzimas CRISPR-Cas para crear un ensayo que pueda detectar pequeñas cantidades de genoma viral ARN en menos de una hora. Doudna compartió el Premio Nobel de Química 2020 por la invención de CRISPR-Cas9 edición del genoma.
Si bien la nueva técnica aún no se encuentra en la etapa en la que compite con la sensibilidad de qRT-PCR, que puede detectar solo unas pocas copias del virus por microlitro de líquido, ya es capaz de recoger niveles de ARN viral, unas 30 copias por microlitro, suficientes para vigilar a la población y limitar la propagación de infecciones.
"No se necesita la sensibilidad de la PCR para detectar y diagnosticar básicamente COVID-19 en la comunidad, si la prueba es lo suficientemente conveniente y rápida", dijo el coautor David Savage, profesor de Molecular y Celular Biología. "Nuestra esperanza era llevar la bioquímica lo más lejos posible hasta el punto en que pudieras imaginar un formato muy conveniente en un entorno en el que puedas hacerte la prueba todos los días, por ejemplo, a la entrada del trabajo".
Los investigadores informarán sus resultados en línea el 5 de agosto en la revista. Nature Chemical Biology.
La Administración de Alimentos y Medicamentos ha autorizado varios ensayos basados en CRISPR para uso de emergencia, pero todos requieren un paso inicial en el que se amplifica el ARN viral para que la señal de detección, que implica la liberación de una molécula fluorescente que brilla bajo luz azul, es lo suficientemente brillante para ver. Si bien esta amplificación inicial aumenta la sensibilidad de la prueba a un nivel similar al de la qRT-PCR, también introduce pasos que hacen que la prueba sea más difícil de realizar fuera de un laboratorio.
El equipo dirigido por UC Berkeley buscó alcanzar una sensibilidad y velocidad útiles sin sacrificar la simplicidad del ensayo.
Además de tener un paso adicional, otra desventaja de la amplificación inicial es que, debido a que produce miles de millones de copias de ARN viral, existe una mayor probabilidad de contaminación cruzada en las muestras de los pacientes. La nueva técnica desarrollada por el equipo le da la vuelta a esto y en su lugar aumenta la señal fluorescente, eliminando una fuente importante de contaminación cruzada. “Para aplicaciones en el punto de atención, desea tener una respuesta rápida para que las personas puedan saber rápidamente si están infectado o no, antes de tomar un vuelo, por ejemplo, o visitar a familiares ”, dijo la líder del equipo Tina Liu, científica investigadora del laboratorio de Doudna en el Instituto de Genómica Innovadora (IGI), un centro centrado en CRISPR que involucra a científicos de UC Berkeley y UC San Francisco.
La técnica sin amplificación, que denominan Fast Integrated Nucleasa Detection In Tandem (FIND-IT), podría permitir pruebas de diagnóstico rápidas y económicas para muchas otras enfermedades infecciosas.
“Si bien comenzamos este proyecto para el expreso Con el propósito de impactar COVID-19, creo que esta técnica en particular podría ser aplicable a algo más que a esta pandemia porque, en última instancia, CRISPR es programable ”, dijo Liu. “Entonces, podría cargar la enzima CRISPR con una secuencia dirigida al virus de la gripe o al virus del VIH o cualquier tipo de virus de ARN, y el sistema tiene el potencial de funcionar de la misma manera. Este documento realmente establece que esta bioquímica es una forma más sencilla de detectar ARN y tiene la capacidad de detectar ese ARN en un marco de tiempo sensible y rápido que podría ser susceptible de aplicaciones futuras en el diagnóstico en el punto de atención ".
Los investigadores están actualmente en el proceso de construir un diagnóstico de este tipo utilizando FIND-IT, que incluiría pasos para recolectar y procesar muestras y ejecutar el ensayo en un dispositivo microfluídico compacto.
Empleando proteínas Cas en tándem
Para eliminar la amplificación del objetivo de la ecuación, el equipo empleó una enzima CRISPR: Cas13 - para detectar primero el ARN viral y otro tipo de Proteínas Cas proteína, llamado Csm6, para amplificar la señal de fluorescencia.
Cas13 es una tijera de uso general para cortar ARN; una vez que se une a su secuencia objetivo, especificada por un un ARN guía, está preparado para cortar una amplia gama de otras moléculas de ARN. Esta actividad de corte activada por la diana se puede aprovechar para acoplar la detección de una secuencia de ARN específica a la liberación de una molécula indicadora fluorescente. Sin embargo, por sí solo, Cas13 puede requerir horas para generar una señal detectable cuando están presentes cantidades muy bajas de ARN objetivo.
La idea de Liu fue utilizar Csm6 para amplificar el efecto de Cas13. Csm6 es una enzima CRISPR que detecta la presencia de pequeños anillos de ARN y se activa para cortar una amplia gama de moléculas de ARN en las células.
Para impulsar la detección de Cas13, ella y sus colegas diseñaron una molécula activadora especialmente diseñada que se corta cuando Cas13 detecta ARN viral. Un fragmento de esta molécula puede unirse y provocar que Csm6 corte y libere una molécula fluorescente brillante a partir de un fragmento de ARN. Normalmente, la molécula activadora es rápidamente degradada por Csm6, lo que limita la cantidad de señal fluorescente que puede generar. Liu y sus colegas idearon una forma de modificar químicamente el activador para que esté protegido de la degradación y pueda sobrecargar Csm6 para cortar y liberar repetidamente moléculas fluorescentes unidas al ARN. Esto da como resultado una sensibilidad 100 veces mejor que la del activador original.
"Cuando se activa Cas13, escinde este pequeño activador, eliminando un segmento que lo protege", dijo Liu. “Ahora que está liberado, puede activar muchas moléculas diferentes de esa segunda enzima, Csm6. Y así, un objetivo reconocido por Cas13 no solo conduce a la activación de su propia capacidad de corte de ARN; conduce a la generación de muchas más enzimas activas que pueden rompen reporteros aún más fluorescentes ".
El equipo de investigadores también incorporó una combinación optimizada de ARN guía que permite un reconocimiento más sensible del ARN viral por Cas13. Cuando esto se combinó con Csm6 y su activador, el equipo pudo detectar hasta 31 copias por microlitro de SARS-CoV-2 ARN en tan solo 20 minutos.
Los investigadores también agregaron ARN extraído de muestras de pacientes al ensayo FIND-IT en un cartucho de microfluidos, para ver si este ensayo podría adaptarse para ejecutarse en un dispositivo portátil. Usando un pequeño dispositivo con una cámara, pudieron detectar el ARN del SARS-CoV-2 extraído de muestras de pacientes con una sensibilidad que capturaría las infecciones por COVID-19 en su punto máximo.
"Este enfoque de nucleasa en tándem, Cas13 más Csm6, combina todo en una sola reacción a una sola temperatura, 37 grados Celsius, por lo que no requiere calentamiento a alta temperatura o múltiples pasos, como es necesario para otras técnicas de diagnóstico", dijo Liu. "Creo que esto abre oportunidades para pruebas más rápidas y simples que pueden alcanzar una sensibilidad comparable a otras técnicas actuales y potencialmente podrían alcanzar sensibilidades aún más altas en el futuro".
El desarrollo de este método sin amplificación para la detección de ARN resultó de una reorientación de la investigación dentro de IGI cuando la pandemia comenzó hacia problemas de diagnóstico y tratamiento de COVID-19. Finalmente, cinco laboratorios en UC Berkeley y dos laboratorios en UCSF se involucraron en este proyecto de investigación, uno de los muchos dentro del IGI.
“Cuando comenzamos esto, teníamos la esperanza de crear algo que alcanzara la paridad con la PCR, pero que no requiriera amplificación, ese sería el sueño”, dijo Savage, quien fue el investigador principal del proyecto. “Y desde una perspectiva de sensibilidad, teníamos una brecha de diez mil veces para saltar. Lo hemos multiplicado por mil; lo hemos reducido en unos tres órdenes de magnitud. Entonces, casi estamos allí. En abril pasado, cuando realmente estábamos empezando a trazarlo, eso parecía casi imposible ".
El trabajo fue apoyado por la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (N66001-20-2-4033). Los coautores del artículo incluyen a miembros de los laboratorios de Jennifer Doudna, David Savage, Patrick Hsu, Liana Lareau y Daniel Fletcher en UC Berkeley; Gavin Knott de la Universidad de Monash en Australia; Melanie Ott y Katherine Pollard en los Institutos Gladstone y UCSF; y Ming Tan en Wainamics, una firma de investigación y desarrollo en Pleasanton, California, que produce dispositivos de microfluidos. Doudna, fundador de IGI y actual presidente y presidente de la junta de gobierno de IGI, es el presidente del canciller Li Ka Shing en UC Berkeley y profesor de química y biología celular y molecular. Hsu, Lareau y Fletcher son profesores del Departamento de Bioingeniería.
Esta historia fue publicada originalmente por el Noticias de UC Berkeley.
Aprende más:
- Detección acelerada de ARN utilizando nucleasas CRISPR en tándem (Nature Chemical Biology)
- La nueva prueba COVID-19 basada en CRISPR utiliza cámaras de teléfonos inteligentes para detectar el ARN del virus (Diciembre 2020)
Contacto para los medios: Andy Murdock, andymurdock@berkeley.edu
