Elecciones, Elecciones

Si solo te estás metiendo en edición del/Cas9 Al editar, puede que te sientas un poco abrumado por todas las opciones disponibles, especialmente si trabajas con células humanas. Solo tienes que echar un vistazo a las Página CRISPR de mamíferos de Addgene¡¿Cuál elegir?! Hay varias etiquetas, cantidades de NLS, ubicaciones de etiquetas/NLS, promotores, sgRNA+Cas9 en un vector, y la lista continúa.

Una postdoctora en el laboratorio, Pei-Chun Lin, quería prepararse para sus propios proyectos de eliminación probando algunos de los sistemas Cas9 en una comparación de manzanas con manzanas. Este es el uso más sencillo de Cas9: haga un solo corte y observe un gen El producto desaparece. Pei-Chun obtuvo un HEK293 (SCD por sus siglas en inglés), línea que expresaba YFP de manera estable y probó varios sgRNA para encontrar algunos que funcionaran con eficiencias variables, luego usó esas dos guías con cinco configuraciones diferentes, incluidos vectores sgRNA y Cas9 todo en uno y separados. Transfectó transitoriamente cada Cas9/sgRNA durante 72 horas, luego leyó la eficiencia de corte en varios momentos con fluorescencia de YFP (para monitorear la desaparición de la proteína) y el ensayo de endonucleasa T7 (para monitorear indeles genómicos causados ​​por el corte de Cas9).

Como era de esperar, todos los sistemas funcionan cuando se les da un gran ARNg (¡uf!), Con una eficiencia variable (compare la guía YFP # 6 entre Cas9s). El sistema Cas9 con la actividad aparente más baja (Addgene #50661) tiene el gran beneficio de la inducibilidad, por lo que todavía hay una gran razón para usarlo. Pero las diferentes eficiencias significan que los sgRNA que se ven decentes con un vector Cas9 pueden parecer inactivos cuando se combinan con otro (por ejemplo, compare la guía YFP # 4 cuando se usa con Cas9 #41815 vs #43861).

Los datos de Pei-Chun también destacan la diferencia temporal entre crianza de organismos con mutación deseada y abundancia de proteínas (como podría ser causado por proteínas altamente estables). Las ediciones genómicas fueron fácilmente detectables después de 3 días por T7E1, pero tomó 6 días incluso comenzar a detectar un cambio en la abundancia de proteínas. No es inesperado, dada la estabilidad conocida de los XFP, pero tenga esto en cuenta la próxima vez que planifique un ensayo occidental u otro basado en proteínas para leer la actividad de Cas9.

Aquí están todos los datos en formato PDF.

By maíz jacob

Jacob Corn es profesor de biología del genoma en ETH Zürich. El laboratorio de maíz estudia la intersección de la reparación del ADN humano y las herramientas de edición del genoma y desarrolla nuevos enfoques para curar enfermedades humanas mediante la edición del genoma.