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CRISPRpedia

Tecnología CRISPR

Científico a cargo de la revisión Ross Wilson

Introducción ¿Cómo utilizan los científicos las herramientas CRISPR en el laboratorio?

Los científicos tomaron proteínas CRISPR naturales y las reinventaron como herramientas para manipular el genoma en otros organismos. Este capítulo de CRISPRpedia describe una variedad de herramientas basadas en CRISPR, cómo funcionan y cómo se pueden usar para la investigación.

Descargar recursos gráficos (CC BY-NC-SA 4.0)

Cas9: De la naturaleza al laboratorio

La proteína bacteriana Cas9 ha sido cooptada como una herramienta de edición del genoma para su uso en cualquier organismo.

Vocabulario
CRISPR RNA/crRNA, doble guía RNA/dgRNA, guía única RNA/sgRNA, núcleo, eucariotas, procariotas, señal de localización nuclear/NLS, histonas

Dos usos diferentes para el corte programable de ADN

Como se discutió en el capítulo previo, hay muchos sistemas CRISPR naturales que protegen bacterias fotosintéticas Desde virus. Pero un sistema CRISPR en particular ha abierto la puerta a una nueva era en la investigación biológica. Esto es CRISPR-Cas9, que ha sido reutilizado como una herramienta para modificar secuencias de ADN objetivo en un proceso llamado edición del genoma basado en CRISPR. Antes de sumergirnos en los detalles de cómo funciona la edición del genoma, , revisaremos cómo funciona Cas9 en la naturaleza y qué tiene de diferente su uso como herramienta de edición del genoma. Los componentes centrales involucrados tanto en la inmunidad CRISPR como en la edición del genoma son:

  • La proteína CasXNUMX — tijeras moleculares que cortan el ADN
  • A un ARN guía — una molécula pequeña y personalizable que dirige a Cas9 para cortar una secuencia de ADN específica

Tanto la inmunidad bacteriana como la edición del genoma dependen de la capacidad de Cas9 para encontrar y cortar objetivos de ADN específicos en función de la secuencia de su moléculas de ARNguía. Veamos algunas diferencias importantes entre estos dos contextos: entrega, composición del ARN guía, variedad de proteínas Proteínas Cas y diferecias entre características procariotas vs eucariotas células.

Entrega

¿Cómo entra Cas9 en una célula? En la naturaleza, el ADN bacteriano codifica el sistema CRISPR-Cas9. Pero Cas9 no está codificado naturalmente en organismos complejos como plantas o humanos, ni en todos los microbios que nos gustaría estudiar, por lo que los investigadores deben agregar o "entregar" el sistema a estos organismos para la edición del genoma. Para hacerlo, deben atravesar las barreras celulares. Los investigadores eluden estas barreras de varias maneras, según el tipo de organismo con el que estén trabajando y exactamente lo que estén tratando de hacer.

Algunas formas comunes de agregar herramientas CRISPR a las células en el laboratorio incluyen plásmidos transformadores (para bacterias), electroporación, estimulación química o administración viral (para células humanas), Agrobacterium (para las plantas), y microinyección de óvulos o embriones (para modelos animales como ratones o peces cebra).

Composición del ARN guía

En la naturaleza, Cas9 es guiado por dos moléculas de ARN separadas, a veces llamadas ARN de doble guía (ARNdg):

Los investigadores encontraron una manera de simplificar esto. Combinaron el ARNcr y el ARNtracr para formar una molécula continua conocida como ARN de guía única (ARNsg). Como resultado, los editores de genomas solo necesitan generar un ARN para editar una secuencia de ADN en particular.

variantes de la proteína cas

Las células bacterianas utilizarán cualquier sistema CRISPR que tengan en su lucha contra fagos, pero los investigadores no se limitan a usar solo uno. El sistema CRISPR-Cas9 básico puede hacer mucho, pero tiene limitaciones. Al reconocer esto, los investigadores dedicaron mucho tiempo a desarrollar herramientas CRISPR: primero, crearon versiones más precisas para la edición del genoma. Han desarrollado otras enzimas CRISPR-Cas para la edición del genoma y proteínas Cas diseñadas para cortar objetivos con nuevas secuencias PAM . Incluso han desarrollado sistemas CRISPR que hacen cosas además de cortar el ADN. Puede obtener más información sobre estos cambios en las secciones siguientes.

Células procariotas y eucariotas

Utilizar sistemas CRISPR para editar ADN en células eucariotas (plantas, animales, hongos y protistas) presenta algunos desafíos únicos. Los eucariotes almacenar su ADN en una estructura llamada núcleo. Esto significa que los investigadores tienen que entregar sus herramientas CRISPR no solo a través de la membrana de la célula, sino hasta el núcleo. Agregar una etiqueta corta a la proteína Cas9 conocida como señal de localización nuclear (NLS por sus siglas en inglés) le dice a la célula que lleve a la enzima hacia el núcleo. Una vez dentro, Cas9 puede buscar a través del ADN para encontrar su objetivo.
 
Las células eucariotas organizan sus genomas de formas más complejas que las bacterias. Envuelven su ADN alrededor de proteínas llamadas histonas. Cuando el ADN es enrollado fuertemente de esta forma, Cas9 y otras enzimas CRISPR tienen más dificultades para llegar a él. Esto puede hacer que algunos objetivos sean más difíciles de editar que otros.
 
CRISPR también puede ser usado como herramienta en procariotes (bacterias y arqueas). En este caso, la edición tradicional es difícil porque los procariotes no tienen grandes sistemas de reparación de ADN.Hacer cortes específicos a menudo mata las células en lugar de conducir a la edición del genoma. Los investigadores pueden superar este problema mediante el uso de herramientas CRISPR que no cortan ambas hebrasdel ADN, tales como los editores de bases y CRISPRi (descrito en "Ampliando el kit de herramientas CRISPR").

Estructura y función de Cas9

Cómo los cambios estructurales en la nucleasa Cas9 le permiten cortar el ADN objetivo

Vocabulario
Estructura, dominio, lóbulo de reconocimiento/REC, lóbulo de nucleasa/NUC, HNH, RuvC, dominio de interacción con PAM/PID, hebra objetivo, hebra no objetivo, escisión, efecto fuera del objetivo

Un recorrido por la proteína Cas9 y cómo funciona

CRISPR nucleasas CRISPR como Cas9 encuentran y cortan objetivos de ADN en un proceso de varios pasos. Cada proteína tiene una estructura específica — una forma o arquitectura — que le permite hacer su trabajo. Un ARN guía dirige cada nucleasa CRISPR a las secuencias de ADN o ARN objetivo. Tenga en cuenta que dado que el ARN está escrito en el mismo "lenguaje" genético que el ADN, el ARN y el ADN pueden parear bases entre sí, y un ARN guía puede emparejarse con un ADN o ARN complementario .

La nucleasa tiene varios pasos de control de calidad incorporados que aseguran que solo corte la secuencia de ADN correcta. Aquí, describimos cómo funciona este proceso para Cas9. Muchas enzimas CRISPR siguen principios similares, pero cada una tiene sus propias peculiaridades, como se detalla en el capítulo previo.

Cas9 es una proteína única de dos lóbulos hecha de varias regiones dinámicas llamadas dominios. Puede pensar en los dominios de proteínas como diferentes partes del cuerpo: todos están conectados y trabajan juntos, pero cada uno hace cosas diferentes. Cas9 es bilobulado porque sus dominios forman dos lóbulos: el lóbulo de reconocimiento (abreviado REC) y el lóbulo de nucleasa (NUC). Estos son algo así como la "parte superior" y la "parte inferior" de Cas9. De esta manera, su forma se parece más o menos a una almeja.

El lóbulo REC es importante para transportar el ARN guía. El lóbulo NUC contiene dos dominios de nucleasa separados llamados Hnh y RuvC. Puede pensar en ellos como las dos cuchillas de las "tijeras moleculares" de Cas9. El dominio HNH es bastante grande y móvil, mientras que el dominio RuvC es menos dinámico.

A continuación, veremos cómo cada parte de Cas9 lo ayuda a reconocer y cortar el ADN.

Identificar el objetivo de ADN correcto

reconocimiento de pamCas9 lleva un ARN guía, que se mantiene principalmente en su lóbulo REC. El complejo Cas9-gRNA busca secuencias de ADN coincidentes. El primer paso en el proceso de búsqueda es buscar un PAM, un tramo corto de ADN que se requiere para que Cas9 se una a los objetivos y corte (explicado en detalle en el capítulo previo). El PAM se identifica por una región del lóbulo de la nucleasa llamada dominio que interactúa con PAM (PID). La proteína Cas9 ampliamente utilizada de la bacteria Streptococcus pyogenes reconoce la secuencia PAM, "NGG". Otras nucleasas CRISPR se unen a PAM únicos porque tienen diferentes aminoácidos en sus dominios que interactúan con PAM.

Emparejamiento de basesUna vez unido a un PAM, Cas9 desenrolla la doble hélice de ADN adyacente. Si el ARN guía coincide con el objetivo, se cerrará o bases-emparejarse con la cadena complementaria de ADN (la hebra objetivo). El emparejamiento de bases siempre ocurre en una dirección, comenzando desde las bases justo al lado del PAM, conocida como región semilla, y subiendo hasta el final del ARN guía. La cadena diana de ADN y ARNg con pares de bases se encuentra en el espacio entre los lóbulos REC y NUC. Cas9 se aferra al opuesto o no objetiva en un surco a lo largo de su superficie, manteniendo separadas las dos hebras de ADN.

Si no hay PAM o el ADN adyacente no coincide completamente con el ARN guía, Cas9 seguirá adelante y buscará en otro lugar.

El proceso de corte

Encuadernación completaSi Cas9 ha encontrado un PAM junto a una región de ADN que coincide con su ARN guía, el proceso de corte o escisión del ADN comenzará. Generalmente, Cas9 solo corta después de los 20 nucleótidos del par de bases del ARN guía con el ADN objetivo. Cas9 ocasionalmente ignora algunos desajustes, lo que lleva a corte fuera del objetivo . Lea sobre los esfuerzos para mejorar la precisión de Cas9 en “Mejorando las herramientas CRISPR."

Escisión de diana de ADNUna vez que el ADN objetivo tiene pares de bases en su mayoría o en su totalidad, el dominio HNH se coloca en su lugar y corta la hebra de ADN objetivo. Casi inmediatamente después, el dominio RuvC se posiciona para cortar la hebra de ADN no objetivo. Los dos cortes ocurren a tres nucleótidos de distancia del PAM. Dejan atrás extremos romos de ADN. Sin embargo, el dominio RuvC a menudo "masticará" la hebra que no es el objetivo, dejando pequeñas extensiones sobresalientes.

Después de dividir el ADN, el trabajo de Cas9 está hecho. En la defensa natural del fago, se cree que otras enzimas descomponen por completo el ADN del fago que ha sido cortado. Durante la edición del genoma, las proteínas de reparación celular reparan la brecha.

Para revisar una versión animada de este mecanismo, consulte el módulo Cas9 interactivode HHMI. Para ver más de cerca la estructura de Cas9, pruebe nuestra aplicación gratuita de realidad aumentada, CRISPR-3D.

Edición del genoma CRISPR

Cómo hacer un corte en el ADN provoca un cambio en la secuencia en el sitio de corte

Vocabulario
Edición del genoma, nucleasas con dedos de zinc/ZFN, nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción/TALEN, rotura de doble cadena/DSB, unión de terminación no homóloga/NHEJ, indels, knock out, reparación dirigida por homología/HDR, ADN/plantilla de donante ADN, efectos en el objetivo

¿Cómo reescriben los científicos el ADN?

Edición genómica es el proceso de cambiar una secuencia específica de ADN dentro de una célula viva. Esto podría usarse para todo tipo de propósitos, descritos en CRISPRpedia.

Existen múltiples herramientas de edición del genoma disponibles. Por ejemplo, nucleasas de dedos de zinc (ZFN) y nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN) son herramientas efectivas de edición del genoma que vinieron antes de CRISPR. Los investigadores tienen que rediseñar estas herramientas cada vez que quieran editar una nueva secuencia. Por el contrario, las tecnologías de edición del genoma CRISPR funcionan de manera "conectar y reproducir", lo que las hace mucho más convenientes.

¿Cómo funciona la edición del genoma? Hay dos procesos claves: (1) hacer un corte específico en el ADN genómico y (2) la célula repara ese ADN roto de una manera que cambia la secuencia.

Hacer una ruptura de ADN dirigida

rotura de doble hebraEl primer paso para editar el genoma con CRISPR es programar Cas9 (u otra enzima Cas) con un ARN guía. Los investigadores diseñan la guía para que sea complementaria a una secuencia objetivo particular en el genoma. Agregan Cas9 y su gRNA personalizado a las células que desean editar. Cas9 buscará en todo el genoma, eventualmente encontrará su sitio objetivo y hará un corte en ambas hebras de ADN, también llamado ruptura de doble hebra (DSB por sus siglas en inglés).

CRISPR-Cas9, ZFN y TALEN son tecnologías de edición del genoma que cortan el ADN donde quiera un investigador. Es por eso que a menudo se los describe como "tijeras moleculares". Pero, ¿cómo puede una ruptura del ADN terminar cambiando la secuencia del ADN? Veamos el resto del proceso.

Dos formas comunes de reparar roturas de ADN

Hacer una ruptura de doble cadena en el ADN es solo la primera mitad de la edición del genoma. Depende de la célula hacer el resto. El daño al ADN puede matar una célula, por lo que las células tienen una variedad de diferentes sistemas de reparación para solucionar cualquier problema. Hacer una ruptura de doble cadena hace que la célula envíe un equipo de proteínas de reparación de ADN para reparar la ruptura.

La forma más común en que las proteínas reparadoras cierran una ruptura de ADN es unir nuevamente los dos extremos rotos. Esto ocurre a menudo a través de un proceso llamado unión de extremos no homólogos (NHEJ, por sus siglas en inglés). El proceso de NHEJ puede ser poco riguroso, lo que resulta en pequeñas eliminaciones o inserciones de ADN en el sitio de reparación, abreviadas indeles. Estas pueden inactivar o eliminar los genes.

Imagínese eliminar una palabra de la mitad de una oración o agregar algunas letras al azar. Probablemente la frase ya no tenga sentido. De manera similar, un gen que contiene un indel normalmente dejará de funcionar. Después de romper un gen con NHEJ, los científicos pueden observar los efectos de la desactivación y así aprender qué hace el gen. También puede resultar útil impedir que los genes funcionen cuando tienen efectos negativos en un organismo, como una variante genética que causa una enfermedad humana o hace que una planta sea susceptible a una infección viral.

Uno de los mecanismos de reparación menos comunes es que las células reparen las roturas de ADN agregando nuevas secuencias de ADN. Esto ocurre a través de un proceso llamado reparación dirigida por homología (HDR, por sus siglas en inglés). Con este proceso, los investigadores pueden especificar exactamente qué secuencia de ADN se inserta. Normalmente lo hacen entregando un segmento de plantilla or ADN donante . Para una reparación eficaz, la plantilla de ADN debe contener secuencias que coincidan con los extremos rotos del ADN, denominadas secuencias homólogas. Insertar o reemplazar ADN de esta manera puede reparar genes rotos o cambiar funciones celulares.

¿Qué tipo de reparación ocurrirá?

Controlar qué tipo de reparación ocurre después de que Cas9 hace un corte puede ser difícil. Los pequeños indeles hechos a través de NHEJ son el resultado más común de la edición del genoma. Agregar una plantilla de ADN puede conducir a su inserción en el sitio de corte, pero generalmente no siempre ni en cada célula que el investigador quiere editar. ¡En un solo experimento, no sería sorprendente encontrar solo 1 de cada 1000 células con la inserción correcta! Los DSB también pueden conducir a grandes reordenamientos o eliminaciones no deseadas en los cromosomas en un pequeño porcentaje de células, llamado en el objetivo.

Entonces, ¿qué hacen los científicos? En algunos casos, los investigadores pueden aislar solo las células u organismos que recibieron las ediciones que desean. A veces, agregan moléculas pequeñas o diseñan su ADN de plantilla de una manera que estimula a las células a usar la vía HDR. Los científicos también están desarrollando variaciones de la edición del genoma CRISPR que conducen a resultados de reparación más confiables, como los 'editores de base' que se describen más adelante en "Ampliando el kit de herramientas CRISPR." La mejor estrategia depende exactamente de lo que el investigador está tratando de hacer, y hay espacio para más innovación.

 

🎥 | Hemos analizado los detalles moleculares de la edición del genoma, pero ¿cómo es el proceso para alguien que realiza el procedimiento en la vida real en un laboratorio? Eche un vistazo al interior de uno de nuestros laboratorios y vea cómo se realiza la edición del genoma en el vídeo a continuación.

Refinando las herramientas CRISPR

Hacer que la edición del genoma sea más precisa y versátil

Vocabulario
apodo

¿Dónde hay margen de mejora?

Los experimentos de edición del genoma se basan en herramientas CRISPR para cortar sitios específicos de ADN, lo que lleva a cambios en la secuencia de ADN. Las herramientas CRISPR facilitan mucho la realización de experimentos de edición del genoma, pero tienen importantes limitaciones técnicas:

  • No siempre cortan en el sitio correcto del genoma.
  • Hay algunos límites en los sitios a los que pueden dirigirse

Como aprenderá a continuación, los investigadores están encontrando formas de superar estos desafíos.

Hacer que la edición del genoma sea más precisa

Las herramientas CRISPR no siempre cortan las secuencias de ADN correctas. A veces, si hay una coincidencia parcial entre el ARN guía y el ADN objetivo, es suficiente para que la enzima se una y corte. Un corte de proteína CRISPR en un sitio no deseado se denomina efecto fuera del objetivo. Los editores del genoma normalmente solo quieren editar el objetivo que han seleccionado, por lo que las ediciones fuera del objetivo pueden causar problemas.

Al reconocer este problema, los investigadores han modificado las herramientas CRISPR alterando sus estructuras. Estas enzimas son mejores en seguir las instrucciones de sus guías y rara vez cortan las secuencias incorrectas. Es importante verificar las ediciones fuera del objetivo sin importar qué herramienta CRISPR use, pero el uso de estas variantes de "alta fidelidad" generalmente mejora la precisión. También existen otros métodos para mejorar la precisión, a veces modificando el ARN guía en lugar de ajustar una proteína Cas.

CRISPR nicasas CRISPR hacen que la edición del genoma sea más precisa de una manera diferente. Las enzimas CRISPR como Cas9 generalmente cortan las dos cadenas de ADN. Los investigadores pueden mutar uno de los dominios de corte de Cas9 para evitar que funcione, convirtiendo la enzima en una nicasa. Una nicasa hace un corte en una sola hebra, que se llama mella. Mellas individuales por lo general, no conducen a la edición del genoma por sí solas, pero dos mellas cercanas sí lo hacen. Los científicos pueden cargar las nicasas CRISPR con dos ARNs guía diferentes, dirigiéndolos a sitios de ADN que están muy cercanos y desencadenando la edición del genoma.

¿Por qué este tipo de edición del genoma sería más preciso? Piense en cortar secuencias de ADN con herramientas CRISPR como disparar flechas a objetivos. Incluso un arquero súper hábil ocasionalmente fallará un objetivo. Sin embargo, es poco probable que un arquero habilidoso falle el objetivo de la misma manera dos veces. Del mismo modo, es poco probable que dos nicasas CRISPR creen mellas fuera del objetivo en la misma área del genoma. Los sitios de corte fuera del objetivo pueden estar en cualquier parte del genoma, por lo que es poco probable que ocurran uno al lado del otro. A menos que haya dos mellas muy juntas, no se realizará ninguna edición. Por lo tanto, la edición fuera del objetivo usando doble nicasas es rara.

Creación de nuevas secuencias de ADN editables con variantes de PAM

Las herramientas CRISPR comunes pueden dirigirse a muchas secuencias de ADN. Sin embargo, las herramientas CRISPR generalmente requieren que sus objetivos tengan secuencias de licencia llamadas PAM, explicadas en profundidad en el capítulo previo. Las PAM suelen ser cortas (a veces solo dos nucleótidos), por lo que un científico generalmente puede encontrar una cerca del sitio en el genoma que les gustaría editar. Pero no siempre, y es posible que no puedan encontrar un PAM que permita que la enzima CRISPR corte exactamente donde les gustaría hacer una edición. Por lo tanto, el requisito de PAM limita el número de secuencias de ADN objetivo.

Los investigadores están evadiendo estas limitaciones al descubrir nuevas enzimas CRISPR o al re-diseñar sus herramientas existentes. Pueden buscar digitalmente a través de secuencias de ADN y encontrar sistemas CRISPR con diferentes requisitos PAM. También pueden cambiar el requisito de PAM de una proteína. Para ello, modifican los aminoácidos de la proteína que interactúan con el PAM. ¡Con las técnicas actuales, los investigadores pueden editar esencialmente cualquier secuencia de ADN!

Ampliando el kit de herramientas CRISPR

La edición programable de ADN de CRISPR se puede combinar con otras funciones útiles

Vocabulario
dCas9, fusión, editores de bases, transcribir/transcripción, regulación génica, activador, represor, derribar, reclutar, epigenoma

Convertir Cas9 en una navaja suiza para investigadores

Durante la edición del genoma CRISPR, los investigadores generalmente cortan una secuencia de ADN específica para hacer una edición. Esta técnica se utiliza para muchos proyectos de investigación interesantes. No obstante, el conjunto de herramientas CRISPR tiene muchas herramientas que hacen mucho más que cortar el ADN. A menudo se inventan nuevos métodos, por lo que describimos solo algunas de las herramientas clave en esta sección.

La mayoría de estas herramientas utilizan una proteína CRISPR no cortante llamada Cas9 "muerta", o dCas9 (por sus siglas en inglés), para abreviar. Si las herramientas de corte CRISPR comunes son como flechas apuntadas con precisión, dCas9 es como una flecha con la punta embotada. dCas9 aún puede dirigirse a secuencias de ADN precisas, pero no las corta.

Es posible unir proteínas con varias funciones a dCas9. Esto generalmente se hace mediante la creación de un accesorio físico llamado fusión. Las proteínas fusionadas conservan sus capacidades originales y obtienen la capacidad de dCas9 para encontrar y adherirse a objetivos de ADN específicos. Esto es como atar una carga útil a una flecha desafilada. Los investigadores utilizan estas herramientas para dirigir las actividades de las proteínas a secuencias específicas de ADN.

Edición de ADN directamente con editores base

Editores de base son variaciones del sistema CRISPR-Cas9 que cambian directamente las bases del ADN. Existen enzimas naturales y modificadas que pueden convertir letras individuales en una secuencia de ADN en otras letras. Cuando se fusionan con Cas9, estas enzimas pueden dirigirse a una secuencia de ADN específica. Los editores de base suelen incluir dCas9 o nicasa Cas9. Esto significa que no hay roturas de doble cadena y que la edición de bases no activa los sistemas de reparación desencadenados por la edición tradicional del genoma.

Entonces, los científicos pueden usar editores de base para cambiar con precisión una letra de ADN a otra. Este proceso es como resaltar una sola letra en un documento de texto y reemplazarla con una pulsación de tecla. En este momento, las principales herramientas de edición de base permiten a los investigadores cambiar A por G y C por T. Ha habido un progreso sustancial en la ingeniería de editores de base nuevos y mejorados, y es posible que pronto estén disponibles más de estas herramientas.

Subiendo y bajando la expresión de genes

Los genes codifican proteínas. Para crear una proteína codificada, la célula primero copia o transcribe un gen particular en ARNm. Luego, el ARNm se usa como una hoja de instrucciones que le dice a los ribosomas cómo construir la proteína. Generalmente, si ocurre más transcripción, entonces se crea más proteína codificada. Si hay menos transcripción de ARNm, se produce menos producto proteico de ese ARNm.

Para funcionar correctamente, crecer y reproducirse, las células necesitan ajustar constantemente sus niveles de proteínas individuales. Esto se llama regulación de genes. Para hacer esto, las proteínas reguladoras en la célula pueden aumentar o disminuir la transcripción de un gen, generando más o menos copias de ARNm y más o menos del producto proteico codificado. Una proteína reguladora que aumenta la transcripción se llama activadora, y una proteína que disminuye la transcripción es una represora.

Los investigadores pueden adjuntar uno o más de estos reguladores transcripcionales a dCas9 y programarlo con un ARN guía dirigido a un gen de interés. Cuando el dCas9 se une a su objetivo, el regulador aumenta o disminuye la transcripción del gen. De esta forma, los científicos pueden aprender más sobre la función del gen.

Este enfoque es especialmente útil si la eliminación total o la ruptura de un gen es letal para las células. En cambio, los investigadores pueden reducir la expresión de genes, lo cual se conoce como rebajar el gen, que por lo general permite que las células sobrevivan sin dejar de proporcionar pistas sobre lo que hace el gen.

¿Cómo controlan realmente la transcripción los reguladores dCas9? En algunos casos, se cree que dCas9 bloquea físicamente proteínas como la ARN polimerasa para que no se unan cerca de los genes, lo que impide la transcripción. A veces, las proteínas reguladoras atraen o reclutan otras proteínas que afectan la transcripción. Esto también se puede hacer modificando directamente el epigenoma con herramientas CRISPR, explicado en la siguiente subsección.

Hacer modificaciones epigenéticas

Todo el ADN de una célula se denomina genoma. El epigenoma es un conjunto de modificaciones químicas en el ADN y las proteínas especiales alrededor de las cuales se envuelve el ADN, las histonas. Estas marcas químicas pueden afectar la transcripción, activando o reprimiendo genes. Si imaginamos que el genoma es un libro de cocina y los genes son recetas, hacer una marca epigenética es como agregar una nota adhesiva a una receta que dice "¡Haz más de esto!" o "¡Haz menos!"

Los efectos de las modificaciones epigenéticas pueden ser complejos, pero los investigadores conocen muchas de las proteínas que las producen. Al unir proteínas modificadoras del epigenoma a dCas9, los científicos pueden dirigirlas a genes específicos para "aumentar" o "disminuir" la expresión. Por lo general, los modifican justo antes del comienzo de un gen, en una región llamada promotor, donde la maquinaria de transcripción debe unirse antes de transcribir un gen en ARNm.

Algunas de las herramientas de edición epigenética más comunes consisten en dCas9 fusionado con una enzima metiltransferasa, que agrega grupos metilo al ADN. La metilación del ADN puede prevenir parcial o totalmente la transcripción. Por lo tanto, las dCas9-metiltransferasas "disminuyen" o "desactivan" los genes.

Por el contrario, los investigadores pueden activar genes utilizando dCas9-desmetilasas, que eliminan los grupos metilo. dCas9 también se puede fusionar con una acetilasa, una enzima que agrega grupos acetilo a una parte de la histona llamada cola. Estas marcas de acetilo tienden a "abrir" el ADN y aumentar la transcripción.

Las ediciones epigenéticas directas tienden a activar o desactivar los genes de forma más completa y permanente. que los reguladores CRISPR descritos en la subsección anterior, pero depende del diseño experimental. Los científicos pueden usar editores epigenéticos CRISPR para aprender sobre las complejas consecuencias de las modificaciones epigenéticas.

Hacer que las secuencias de ADN brillen

Hay muchos tipos de proteínas y pequeños colorantes químicos que emiten luz. Vienen en todos los colores del arcoíris. Una de las proteínas fluorescentes más conocidas es proteína verde fluorescenteo GFP.

Los investigadores pueden fusionar una proteína fluorescente o un colorante con dCas9. Dirigir un dCas9 marcado con fluorescencia a una secuencia de ADN específica hará que se ilumine. Luego, los investigadores pueden usar microscopios especiales para rastrear cómo estas secuencias interactúan con otras partes de la célula, detectar cuándo se unen otras proteínas fluorescentes en el mismo sitio y más. Interacciones como estas pueden influir en importantes funciones celulares.

 

🎥 | Para revisar el proceso básico de edición del genoma y ver cómo funcionan otras herramientas en el kit de herramientas CRISPR, echa un vistazo a la animación a continuación.

Uso de CRISPR para investigación básica

Al alterar los genes y ver qué sucede, podemos aprender qué hacen esos genes

Vocabulario
Investigación básica, hipótesis, hipótesis, expresión génica, represión génica, activación de CRISPR/CRISPRa, inhibición de CRISPR/CRISPRi, organismo modelo

Aprender hechos fundamentales sobre biología a través de la experimentación

Los científicos pueden hacer una gran variedad de preguntas sobre el mundo y no toda la investigación está diseñada para resolver un problema. Investigación básica implica explorar aspectos fundamentales de la naturaleza y la biología, y a menudo está motivada por la curiosidad, el asombro y la fascinación. 

Los investigadores utilizan herramientas CRISPR para responder muchas preguntas básicas de investigación sobre cómo los genes y los genomas influyen en el funcionamiento de las células y los organismos. Este estilo de experimentación generalmente implica realizar cambios en los genes y buscar efectos en la célula o el organismo. Ajustar genes ha sido posible durante muchos años, pero CRISPR acelera el proceso de manera espectacular y puede permitir modificaciones en organismos que no se habían estudiado antes. Los tipos de modificaciones genéticas que realizan los científicos de investigación básica se dividen en cuatro categorías principales:

  1. Eliminar genes
  2. Aumentar o disminuir los efectos de los genes
  3. Cambiar las funciones de los genes
  4. Agregar nuevos genes

Las subsecciones a continuación muestran cómo los investigadores usan estas técnicas de modificación para aprender sobre los genes. Cada subsección contiene dos ejemplos. El primer ejemplo muestra cómo un mecánico podría usar una técnica similar para aprender cómo funciona una bicicleta (indicada con 🚲). El segundo ejemplo muestra cómo un investigador de biología podría usar la técnica para aprender cómo funciona un gen de una planta (marcado con 🌺).

Rompiendo genes para aprender sobre lo que hacen

Con la edición del genoma basada en CRISPR, los investigadores pueden borrar o eliminar genes específicos. Al eliminar o estropear partes clave de la secuencia de un gen, lo "rompen" o impiden que funcione. Al monitorear los efectos de romper el gen, obtienen pistas sobre lo que hace normalmente el gen. Por ejemplo, romper un gen podría cambiar un rasgo observable. Uno podría entonces hacer una conjetura informada o hipotetizar que el gen controla ese rasgo. Experimentos adicionales refinarán esta hipótesis y aumentarán el entendimiento.

🚲 | Un mecánico podría usar una técnica similar para aprender cómo funciona una bicicleta. El mecánico empieza por destrozar los frenos de la moto. Luego, el mecánico hace que un voluntario monte la bicicleta. Como resultado, el voluntario tiene dificultad para detenerse. Entonces, el mecánico concluye que es probable que los frenos permitan que los ciclistas se detengan. El mecánico está haciendo una hipótesis — una idea sobre cómo podrían funcionar las cosas en base a una observación. Una hipótesis se puede probar con más experimentos, que la apoyarán o la refutarán.

🌺 | De manera similar, los investigadores de biología aprenden qué hacen los genes de las plantas. Los investigadores comienzan usando la edición del genoma CRISPR para romper un gen específico. Más tarde, notan que los pétalos de las flores de la planta cambian de azul a blanco. Entonces, plantean la hipótesis de que el gen controla el color de la flor. ¡Este es un buen punto de partida para futuros experimentos!

Cambiar el efecto de un gen "hacia arriba" o "hacia abajo"

Las herramientas CRISPR se pueden usar para activar o "aumentar" la función genética, como subir el volumen de un televisor. Recuerde que los genes son las instrucciones para las proteínas, por lo que activar un gen significa decirle a la célula que produzca más de la proteína que codifica el gen. Esto se conoce como aumentar la capacidad de expresióndel gen. Los genes también pueden "disminuirse", por lo que la célula produce menos de la proteína que codifican. Se llama represión de genes. Dos métodos CRISPR utilizados para hacer esto son activación CRISPR (CRISPRa, aumentando la expresión) y Inhibición de CRISPR (CRISPRi, disminuyendo la expresión).

Los investigadores suben y bajan los genes para probar hipótesis sobre lo que hacen.

🚲 | El mecánico puede usar una técnica similar para aprender más sobre los frenos. El mecánico puede "aumentar" los frenos agregando más a una bicicleta. Con frenos adicionales, el mecánico plantea la hipótesis de que un ciclista se detendrá más fácilmente.

El mecánico agrega más frenos a una bicicleta y observa un paseo voluntario. El voluntario se detiene más rápido cuando frenan. Los frenos ayudan a las bicicletas a detenerse.

🌺 | Los investigadores de biología saben que su gen afecta el color de las flores. Tienen la hipótesis de que aumentar la función del gen hará que su flor sea más colorida. Usan herramientas CRISPR para aumentar la expresión del gen y las flores de la planta se vuelven de un azul más profundo. Este resultado proporciona evidencia que respalda su hipótesis original, que el gen controla el color de la flor. También permite a los investigadores refinar su hipótesis, haciéndola más específica. Ahora creen que el gen controla la producción de un pigmento azul. Llegan a la conclusión de que aumentar la función del gen significa que se produce más pigmento, lo que hace que las flores sean de un azul más oscuro.

Uso de herramientas CRISPR para cambiar la función de los genes

Editar la secuencia de un gen con CRISPR puede cambiar cómo el gen funciona o lo que hace. Es difícil diseñar ediciones que tengan un efecto específico en la función del gen sin tener una idea bastante buena de cómo funciona el gen. Esta información generalmente proviene de experimentos y observaciones anteriores.

🚲 | Del mismo modo, el mecánico puede alterar los frenos para aprender más sobre ellos. El mecánico sabe que los frenos ayudan a los ciclistas a detenerse y nota que los frenos están conectados a la rueda trasera de la bicicleta. El mecánico no está seguro de si esta conexión es importante. El mecánico piensa que probablemente solo sea importante que los frenos se conecten a la a rueda. El mecánico plantea la hipótesis de que si cambian los frenos para conectarlos a la rueda delantera, la bicicleta seguirá deteniéndose.

El mecánico conecta los frenos a la rueda delantera. Posteriormente, un ciclista aún puede detenerse. Este resultado proporciona evidencia que apoya la hipótesis del mecánico. Los frenos se pueden conectar a la rueda delantera o trasera y la bicicleta seguirá deteniéndose.

🌺 | Los biólogos conocen un gen involucrado en el color de las hojas que tiene una secuencia similar al gen que han relacionado con el color de las flores. Tras un examen minucioso, notaron que el comienzo de los genes es bastante similar, pero los extremos son muy diferentes. Las flores y las hojas son de diferentes colores, por lo que plantean la hipótesis de que los extremos de estos genes son las partes que controlan el color.

Para probar esta hipótesis, los investigadores reemplazaron el final del "gen del color de la flor" con el final del "gen del color de la hoja". ¡Como resultado, los pétalos de las flores se vuelven verdes! Este resultado proporciona evidencia para su hipótesis. El "gen del color de la flor" es importante para dar color a la flor, y el final del gen controla qué color se desarrolla.

Uso de herramientas CRISPR para agregar nuevos genes a los organismos

Por último, los investigadores pueden usar tecnologías CRISPR para insertar genes completamente nuevos en organismos. Cuando se le da un nuevo gen, un organismo puede adquirir una habilidad. Esta es una buena evidencia de que el gen controla esta habilidad.

🚲 | El mecánico puede aprender aún más sobre los frenos añadiéndolos a un vehículo diferente. El mecánico tiene una patineta y conoce mucho sobre las patinetas. Esta patineta en particular no tiene mecanismo de parada. Por lo tanto, el mecánico plantea la hipótesis de que agregar frenos a la patineta permitirá que el patinador se detenga. Un voluntario que conduce la patineta modificada puede detenerse. Este resultado proporciona evidencia para la hipótesis del mecánico. Los frenos permiten a los patinadores detenerse.

🌺 | Los investigadores de biología también necesitan controlar sus condiciones experimentales. Los tres primeros experimentos con plantas fueron controlados. En estos experimentos, los investigadores compararon directamente plantas con y sin cambios genómicos. Solo vieron un cambio cada vez. Como resultado, los investigadores pudieron atribuir los cambios observados a los cambios genómicos que realizaron con la edición del genoma CRISPR.

Al agregar un nuevo gen a un organismo, los investigadores necesitan saber qué efectos están buscando. Luego pueden elegir un organismo donde estos efectos sean fáciles de medir. Por esta razón, los investigadores a menudo insertan nuevos genes en organismos modelo. Estos son organismos bien estudiados cuyo crecimiento y biología se entienden bien. En estos organismos, es fácil detectar cambios en la actividad biológica.

Por ejemplo, los investigadores de plantas quieren insertar su “gen del color de la flor” en una planta modelo. Tienen la hipótesis de que esto hará que las flores de la nueva planta se vuelvan azules. Sería una mala idea insertar este gen en plantas con flores azules o sin flores. ¡Sería muy difícil observar algún efecto en estas plantas!

Entonces, los investigadores insertan el gen del color de la flor en una planta con flores rojas. Ellos plantean la hipótesis de que los pétalos se volverán morados porque se producirán pigmentos azules y rojos. Pero observan que los pétalos en realidad se vuelven azules. Esto proporciona aún más evidencia de que el gen controla el color de la flor y revela algo nuevo: el gen "azul" de la planta original parece "tomar el control" en la planta modelo de flores rojas, volviendo los pétalos totalmente azules en lugar de agregar un matiz azul al rojo para hacer púrpura. Esta podría ser una observación interesante para explorar en futuros experimentos.

Refinando hipótesis y mejorando la comprensión con CRISPR

Observe cómo los resultados de estos experimentos se complementan entre sí. Los investigadores comienzan con poca comprensión. Los experimentos iniciales de "ruptura" (eliminar genes) proporcionan amplias pistas sobre cómo funcionan las cosas. Experimentos posteriores hacen preguntas más específicas que provienen de estas pistas amplias. De esta forma, se refinan las hipótesis sobre la función de los genes.

Investigadores descubren resultados que mejoran gradualmente la comprensión. Hacer experimentos para probar hipótesis a menudo conduce a observaciones inesperadas que brindan a los científicos nuevas ideas para explorar más adelante. Eventualmente entenderán lo suficiente para predecir cómo las modificaciones genéticas cambiarán la biología de un organismo. En el pasado, este era un proceso que requería mucho tiempo, pero las tecnologías CRISPR lo aceleran todo. Estamos aprendiendo cada vez más cómo funcionan los genes y los organismos.

Cribados CRISPR

Aprender sobre muchas partes del genoma, todo en un gran experimento

Vocabulario
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Uso de CRISPR para vincular genes a rasgos

A través del tiempo se secuencian más genomas cada vez. Sin embargo, incluso en organismos ampliamente estudiados, todavía no sabemos qué hacen todos los genes o cómo ciertas secuencias de ADN ayudan a controlar la expresión genética. Usando herramientas CRISPR, podemos editar genes para aprender sobre las proteínas que codifican. Es fácil para los investigadores editar genes individuales usando herramientas CRISPR. Es mucho más difícil identificar los genes desconocidos responsables de los rasgos celulares. Los investigadores podrían editar y probar cada gen uno por uno, pero eso llevaría mucho tiempo.

Los cribados genéticos ofrecen una alternativa más rápida. Los investigadores usan herramientas CRISPR para detectar muchos genes en un solo experimento. La palabra “cribado” significa buscar o probar sistemáticamente. Cuando se aplican a las tecnologías CRISPR, los cribados permiten a los investigadores probar genes sistemáticamente.

Agrupados Cribados CRISPR agrupados permiten a los investigadores probar decenas de miles de objetivos genéticos a la vez. Debido a que se pueden modificar tantos objetivos de ADN en un experimento, incluidos todos los ~20,000 25,000–XNUMX XNUMX genes en el genoma humano, estos a menudo se denominan cribados en todo el genoma. pantallas.

En un cribado CRISPR agrupado, los investigadores administran proteínas CRISPR más una biblioteca agrupada de ARNs guía (ARNg) a un gran lote de células. Al igual que una biblioteca real contiene muchos libros diferentes, una biblioteca de ARNg es una mezcla de muchos ARNs guía, las moléculas pequeñas y personalizables que guían a las proteínas CRISPR como Cas9 a objetivos de ADN específicos.

Los investigadores agregan la cantidad justa de Cas9 y guían los ARN (por lo general, estos componentes se agregan al introducir el ADN que los codifica) a la mezcla para garantizar que, en promedio, solo un ARNg termine dentro de cada célula. El objetivo es ver el efecto de modificar un gen a la vez, en lugar de los efectos complicados que podrían ocurrir cuando las enzimas CRISPR alteran múltiples genes en una sola célula.

Luego, los investigadores cultivan todas las células en condiciones específicas que solo permiten que sobrevivan las células que exhiben un cierto rasgo. Este proceso de eliminar deliberadamente un subconjunto de células en una población mixta se denomina "selección". La selección revela si la modificación CRISPR afecta un rasgo particular. Luego, los investigadores identifican los genes objetivo en las células afectadas mediante la secuenciación de los ARNg restantes (o el ADN que codifica los ARNg). En las células que murieron, todo el ARN y el ADN se destruyen y no aparecerán en los resultados de la secuenciación. Las secuencias de ARNg que aparecen deben provenir de células sobrevivientes, y los investigadores pueden observar a qué genes se dirigieron esos ARNg. Es probable que estos genes tengan algún vínculo biológico con el rasgo de interés. Incluso pueden causarlo directamente. Cubriremos la selección y el análisis con más detalle en las siguientes subsecciones.

A diferencia de un cribado agrupado, en un cribado CRISPR ordenado CRISPR, los genes se seleccionan uno por uno, pero muchos se prueban en paralelo. Las células se mantienen en 'pocillos' individuales de una placa de múltiples pocillos y se analiza un gen objetivo en cada pocillo; básicamente, en lugar de un solo plato de células, los investigadores usan un plato con múltiples pozos separados en el interior, casi como docenas de tubos de ensayo individuales todos unidos con cinta adhesiva en un solo bloque. Esto les permite hacer muchos experimentos en objetivos de ADN individuales en paralelo. Los cribados CRISPR ordenados se usan con menos frecuencia y generalmente se limitan a probar docenas o cientos de objetivos a la vez, por lo que en esta sección nos enfocamos en describir cribados agrupados de todo el genoma.

Los cribados CRISPR pueden implicar realizar ediciones directas en el ADN, como eliminar un gen. También pueden realizar modificaciones más sutiles, como disminuir la expresión genética, que se describe en “Ampliando el kit de herramientas CRISPR" arriba. A veces, los investigadores ni siquiera quieren apuntar directamente a los genes; en su lugar, pueden usar un cribado CRISPR para estudiar secuencias 'no codificantes' en el genoma, que no codifican proteínas y, a veces, son erróneamente denominadas como "ADN basura". Esto puede ayudar a revelar cosas como por ejemplo sobre cómo se regulan los genes.

Selección y análisis de los resultados de un cribado CRISPR

Los investigadores necesitan formas fáciles de examinar las células modificadas en cribados CRISPR agrupados. Podemos pensar en estos investigadores como buscadores de oro. Deben determinar si una mina (experimento) tiene oro (genes específicos que afectan el rasgo de interés). También quieren limitar la cantidad de tierra (células) que tienen que filtrar.

La selección es una excelente manera de analizar un gran número de células. Las selecciones vienen en dos versiones:

En un selección positiva, las células mueren si la modificación basada en CRISPR no afecta el rasgo de interés. Las células viven cuando la modificación del objetivo afecta el rasgo de interés. Los investigadores solo necesitan examinar las células sobrevivientes para encontrar genes que impacten el rasgo de interés. Esto es como un buscador de oro que obtiene un mapa de todos los sitios mineros llenos de oro en el área.

Por ejemplo, supongamos que los investigadores quieren encontrar genes que aumenten la resistencia bacteriana a los antibióticos. Ellos pueden utilizar herramientas CRISPR para activar muchos genes diferentes en un lote de células bacterianas, donde cada célula tiene solo un gen activado por una herramienta CRISPR. Para una selección positiva, podrían intentar hacer crecer la bacteria en una placa de petri con un antibiótico. Normalmente, todas las bacterias morirían. Las bacterias que crecen son capaces de resistir el antibiótico. Esto significa que los genes activados en estas bacterias supervivientes probablemente aumenten la resistencia a los antibióticos. Los experimentos de seguimiento podrían confirmar esto y descubrir cómo estos genes aumentan la resistencia a los antibióticos.

En un selección negativa, las células mueren si la modificación basada en CRISPR afecta el rasgo de interés. Las células viven cuando la modificación de interés no afecta el rasgo de interés. Pero no se pueden analizar las células muertas, entonces, ¿cómo se puede saber qué genes fueron modificados en las células que ya no están? Los investigadores buscan ver qué secuencias de ARN guía en presentes todavía, y trabajar hacia atrás en un proceso de varios pasos:

  • Primero, crean una lista de todos los genes que fueron modificados con la biblioteca de ARNg.
  • Luego, crean una lista de todos los genes modificados en las células sobrevivientes.
  • Finalmente, restan la segunda lista de la primera lista. Los genes modificados en las células muertas permanecen. Es probable que estos genes tengan un impacto en el rasgo.

Esto es como un buscador de oro que obtiene una lista de todos los sitios mineros que no tienen oro. El buscador puede usar esta lista para determinar qué sitios do sí tienen oro. Sólo necesitan hacer referencia a otra lista de todo el los sitios mineros primero. Esto requiere un paso adicional, pero aun así es más rápido que examinar cada mina individualmente.

Por ejemplo, supongamos que los investigadores quieren encontrar genes que permitan a las bacterias comer un tipo particular de azúcar. Pueden usar una proteína CRISPR y una biblioteca de ARNg para inactivar muchos genes diferentes en un cultivo de células bacterianas, donde cada célula tiene solo un gen reprimido o eliminado. Para una selección negativa, podrían intentar hacer crecer la bacteria en un plato con el azúcar como única fuente de alimento. La mayoría de las bacterias sobrevivirán, pero las que mueren ya no pueden usar ese azúcar como fuente de alimento. Esto significa que los genes que se desactivaron en esas bacterias probablemente estén involucrados en la digestión del azúcar. Los experimentos de seguimiento podrían validar estos hallazgos y descubrir cómo estos genes permiten que las bacterias se coman el azúcar.

A veces, la selección no es posible, pero los investigadores pueden tener formas rápidas de examinar cada célula modificada. En estos casos, los cribados CRISPR siguen siendo factibles. Por ejemplo, las células pueden emitir fluorescencia o "brillar" si la selección de genes afecta el rasgo de interés. Esto podría hacerse usando una molécula indicadora como la proteína fluorescente verde. Los investigadores pueden usar varios tipos de equipos de laboratorio para aislar las células brillantes. Luego pueden identificar los genes objetivo en estas células. Es probable que estos genes tengan un impacto en el rasgo de interés. Esto sería como un buscador de oro usando una rejilla para separar el oro de la tierra. El buscador no tiene que examinar toda la tierra a mano, pero sí tiene que pasarla por la rejilla.

En el peor de los casos, los investigadores tienen que examinar tediosamente cada célula. Esto podría suceder si están estudiando un rasgo que necesita un estudio microscópico. Tal examen sería poco práctico con grandes bibliotecas de ARNg. Sería como el buscador de oro que examina a mano toda la tierra de una mina. Es práctico solo si hay una pequeña cantidad de tierra.

Un ejemplo de cribado CRISPR en bacterias

Recorramos un cribado CRISPR hipotético, ilustrado en detalle a continuación.

Imagine que a los investigadores les gustaría encontrar genes que permitan que las bacterias crezcan al comer un azúcar llamado aspartamo. Pueden usar un grupo de ARN guía para reprimir (rechazar la transcripción de) muchos genes diferentes en bacterias, reprimiendo un gen por célula bacteriana.

Luego, los investigadores transfieren las bacterias a un medio de crecimiento que contiene aspartamo como única fuente de alimento. Las bacterias que contienen ARNg que reprimen genes importantes para el crecimiento en aspartamo no deben crecer, así que esto es selección negativa.

Al identificar todos los ARNg que quedan en las bacterias que crecen en el aspartamo, los investigadores también pueden determinar qué ARNg faltan. Al luego verificar los genes a los que se dirigen estos ARNg, pueden crear una lista de genes candidatos que pueden ser importantes para la digestión del aspartamo. Estos genes pueden volver a probarse individualmente y explorarse más en futuros experimentos.

Estudios habilitados por cribados CRISPR

Los investigadores usan cribados CRISPR por muchas razones. Algunos de sus usos recientes incluyen la identificación de genes humanos que:

  • ...impactan la infección por VIH. Comprender cómo los genes humanos afectan la infección por VIH podría permitir nuevos tratamientos. Conozca Más>
  • ...son importantes para la infección por Chlamydia trachomatis . C. trachomatis es una bacteria. Es una de las principales causas de infecciones de transmisión sexual. Entender la infección por C. trachomatis puede conducir a tratamientos nuevos y mejorados. Conozca Más>
  • ...células cancerosas dependen de. Los cánceres como la leucemia mieloide aguda se tratan con quimioterapia, pero no siempre funciona. Si entendemos los genes que son importantes para que el cáncer crezca y se propague, podríamos diseñar nuevos medicamentos que se dirijan a esos genes. Conozca Más>

Los impulsores genéticos

Vocabulario
Impulsión genética

Usando CRISPR para romper las reglas de la genética clásica

Imagina a una adolescente acorralando a uno de sus padres y pidiéndole consejo sobre algo. Luego, le pide consejo a su otro padre sobre lo mismo. En algunos casos, sus consejos serán los mismos, pero a menudo recibirá dos consejos diferentes. 

Los genes funcionan de manera similar. Tienes dos conjuntos completos de genes, uno de cada padre biológico. A veces, los pares de genes son idénticos, pero a menudo terminas con dos versiones diferentes del mismo gen. Tu mezcla específica de genes es parte de lo que te hace ser quien eres.

Ahora imagina que la adolescente se sienta con sus padres y les pide consejo a ambos al mismo tiempo. En algunos casos, estarán de acuerdo. Otras veces, uno de los padres anulará al otro y la hija tendrá que seguir solo sus consejos.

Los impulsores genéticos funcionan como este último escenario. Rompen las reglas normales de la genética. Si un organismo hereda un impulsor genético de un padre biológico y un gen normal del otro, el impulsor genético anulará y reemplazará al gen normal. Se garantiza que transmitirán el impulsor genético a su descendencia, donde se repetirá el proceso de reemplazo.

Los científicos pueden usar herramientas CRISPR para crear impulsores genéticos. Los impulsores genéticos propagan genes elegidos a través de poblaciones de organismos que se reproducen sexualmente con vidas cortas. Por ejemplo, los científicos podrían potencialmente usar impulsores genéticos para propagar un gen a través de muchos, muchos, muchos mosquitos para evitar que transmitan malaria. Si bien los impulsores genéticos no funcionarían bien en humanos, tienen el potencial de mejorar el bienestar humano. Sin embargo, su potencial de amplios efectos viene con posibles impactos ecológicos y cuestiones éticas. Los desarrolladores y las comunidades afectadas deben considerar estos impactos antes de implementar impulsores genéticos.

Impulsores genéticos CRISPR

Existen impulsores genéticos naturales, pero son difíciles de rediseñar. Las herramientas CRISPR permiten a los investigadores crear nuevos impulsores genéticos con fines personalizados. Los impulsores genéticos CRISPR funcionan de la siguiente manera:

  1. Los investigadores generan los organismos iniciales que llevan el impulso genético, que incluye un gen de nucleasa CRISPR, un ARN guía y, por lo general, un gen de "carga" o "carga útil". El cargamento puede ser un gen extraño, pero en la mayoría de los casos es una versión editada de uno de los genes naturales del organismo. 
  2. Los investigadores permitieron que los organismos con impulsores genéticos se aparearan o se reprodujeran con organismos no modificados. Por lo tanto, la descendencia recibirá un cromosoma que lleva el impulsor genético (del mosquito impulsor genético) y la otra copia del cromosoma (del mosquito no modificado) llevará la versión normal del gen.
  3. La nucleasa CRISPR y el ARN guía se producen y se ensamblan juntos. El ARN guía dirige la proteína CRISPR para cortar en el sitio objetivo deseado, que suele ser la versión no alterada del gen de carga.
  4. La célula repara el corte pegando todo el impulsor genético, porque el ADN que rodea los componentes del impulsor genético es homólogo a las secuencias en el sitio de corte (para obtener una descripción general de la reparación dirigida por homología, lea la sección "Edición del genoma CRISPR"). Como resultado, el impulsor genético reemplaza a las otras versiones del gen carga. La descendencia ahora portará el impulso genético en ambas copias del cromosoma.
  5. La descendencia futura hereda el impulsor genético y el proceso de reemplazo se repite. El gen carga se transmite en cada generación y se propaga rápidamente entre la población.

Usos de los impulsores genéticos y sus limitaciones

Los impulsores genéticos pueden propagar genes o rasgos deseados a todos los miembros de una población. Por ejemplo, los impulsores genéticos podrían librar a todos los mosquitos del parásito que causa la malaria. O bien, pueden hacer que cierta maleza sea susceptible a los herbicidas. Incluso podrían esterilizar especies peligrosas, provocando su eventual extinción.

Estas aplicaciones son emocionantes, pero tienen dos limitaciones clave:

  1. Los impulsores genéticos solo se propagan a través de organismos que se reproducen sexualmente. Son ineficaces en muchos tipos de bacterias y otros organismos asexuales.
  2. Los impulsores genéticos solo se propagan a las generaciones futuras. Por lo tanto, las aplicaciones a nivel de población son prácticas en organismos con una vida útil corta, pero no en organismos con una vida útil larga.

Los impulsores genéticos tienen el potencial de tener enormes impactos sociales

Si se implementan, los impulsores genéticos podrían cambiar especies enteras. También impactarían a las sociedades humanas que viven junto a las especies, las usan como alimento o con fines prácticos, o las reverencian. Además, impactar a una especie puede tener efectos dominó imprevisibles en ecosistemas completos.

Para utilizar los impulsores genéticos de manera ética, los investigadores deben comunicar los riesgos y beneficios de la implementación a las sociedades que se verían afectadas. Estas sociedades deberían decidir entonces si implementar impulsores genéticos.

En algunos casos de uso, la sociedad afectada podría abarcar varios países, continentes enteros o incluso el mundo entero, dependiendo de dónde se encuentre una determinada especie. Es poco probable que una sociedad tan diversa alcance un consenso, por lo que es poco probable que se apliquen impulsores genéticos a escala planetaria.

El despliegue responsable de un impulsor genético podría ser más factible en un entorno pequeño y controlado. Por ejemplo, los investigadores podrían implementar impulsores genéticos para erradicar plagas en islas pequeñas. En estas situaciones, las posibilidades de que se propaguen impulsores genéticos inesperados son muy pequeñas. Como tal, la sociedad local podría potencialmente dar su consentimiento para el despliegue de impulsores genéticos.

Mecanismos de control de impulsores genéticos

Algunas preocupaciones en torno a los impulsores genéticos incluyen:

  • Objeciones morales, filosóficas o espirituales a la edición del genoma
  • Efectos ecológicos imprevistos
  • Extenderse más allá del ecosistema previsto

Los investigadores deben responder a la primera preocupación con un diálogo abierto, buscando compartir el conocimiento científico en lugar de imponer opiniones personales. Los investigadores pueden abordar las dos últimas preocupaciones utilizando mecanismos de control. Estos ponen "frenos" a la propagación de impulsores genéticos.

Los mecanismos de control de los impulsores genéticos incluyen:

  1. Limitar la herencia de impulsores genéticos - Los investigadores están desarrollando "impulsores genéticos en cadena". Estos utilizan un "combustible genético" limitado para propagarse a través de un pequeño número de generaciones. Pueden tratar problemas restringidos a pequeñas ubicaciones geográficas.
  2. Creando barreras a la herencia - Es posible modificar genéticamente un organismo para que un impulso genético no lo afecte. Los organismos que están "inmunizados" contra los impulsores genéticos pueden actuar como barreras para la propagación de los impulsores genéticos.
  3. Anular un impulsor genético con otro - Una impulsor genético puede causar problemas inesperados. En este caso, los investigadores pueden liberar un nuevo impulsor genético "de inversión" que podría destruir el impulsor genético original.

Con estos mecanismos, tenemos una mayor capacidad para controlar los impulsores genéticos para responder a resultados imprevistos o no deseados de los impulsores genéticos. Tenga en cuenta que estos controles aún funcionan a través de la modificación genética a gran escala, por lo que también necesitarían la aprobación de la sociedad para implementarse. 

Hasta ahora, los impulsores genéticos se han tratado con extrema precaución. No está claro que los impulsores genéticos se utilicen alguna vez fuera de los entornos de investigación.