Elecciones, Elecciones

Si solo te estás metiendo en CRISPR/Cas9 editar, es posible que se sienta un poco abrumado por todas las opciones disponibles. Especialmente si estás trabajando en humanos. células. Quiero decir, solo eche un vistazo al Página CRISPR de mamíferos de Addgene! ¿¡Cuál elegir!? Hay varias etiquetas, números de NLS, ubicaciones de etiquetas / NLS, promotores, ARNsg+ Cas9 en un vector, y la lista continúa.

Una postdoctora en el laboratorio, Pei-Chun Lin, quería prepararse para sus propios proyectos de eliminación probando algunos de los sistemas Cas9 en una comparación de manzanas con manzanas. Este es el uso más sencillo de Cas9: haga un solo corte y observe un gen el producto desaparece. Pei-Chun obtuvo una línea celular HEK293 de manera estable expresando YFP y probó varios sgRNA para encontrar algunos que funcionaran con diferentes eficiencias, luego usó esas dos guías con cinco configuraciones diferentes, incluidos los vectores sgRNA y Cas9 todo en uno y separados. Transfectó transitoriamente cada Cas9 / sgRNA durante 72 horas, luego leyó la eficiencia de corte en varios momentos con fluorescencia YFP (para monitorear la desaparición del proteína) y el T7 endonucleasa ensayo (monitorear genómico indeles causado por el corte Cas9).

Como era de esperar, todos los sistemas funcionan cuando se les da un gran ARNg (¡uf!), Con una eficiencia variable (compare la guía YFP # 6 entre Cas9s). El sistema Cas9 con la actividad aparente más baja (Addgene #50661) tiene el gran beneficio de la inducibilidad, por lo que todavía hay una gran razón para usarlo. Pero las diferentes eficiencias significan que los sgRNA que se ven decentes con un vector Cas9 pueden parecer inactivos cuando se combinan con otro (por ejemplo, compare la guía YFP # 4 cuando se usa con Cas9 #41815 vs #43861).

Los datos de Pei-Chun también destacan la diferencia temporal entre crianza de organismos con mutación deseada y abundancia de proteínas (como podría ser causado por proteínas altamente estables). Las ediciones genómicas fueron fácilmente detectables después de 3 días por T7E1, pero tomó 6 días incluso comenzar a detectar un cambio en la abundancia de proteínas. No es inesperado, dada la estabilidad conocida de los XFP, pero tenga esto en cuenta la próxima vez que planifique un ensayo occidental u otro basado en proteínas para leer la actividad de Cas9.

Aquí están todos los datos en formato PDF.

By maíz jacob

Jacob Corn es profesor de biología del genoma en ETH Zürich. El laboratorio de maíz estudia la intersección de la reparación del ADN humano y las herramientas de edición del genoma y desarrolla nuevos enfoques para curar enfermedades humanas mediante la edición del genoma.