Hasta la fecha, la mayoría de las publicaciones de mi blog han hablado sobre aspectos generales que rodean el negocio de la ciencia. Pero hoy es el momento de los datos reales. Fuera hoy en Nature Biotechnology es nuestro artículo sobre nuevos conocimientos sobre Cas9 mecanismo y su uso para mejorar el reemplazo de secuencia precisa en humanos células.
TL; DR Cas9 "solapa" parte de la ADN objetivo y puede aprovechar eso para aumentar la frecuencia de HDR, por sus siglas en inglés.
Comenzamos con una pregunta muy simple: ¿qué sucede entre el corte Cas9 y la aparición de genoma, ediciones? Esto podría responderse de diversas formas interesantes, incluida la elucidación de los mecanismos de reparación del ADN. Elegimos ir aún más simple y descubrir cómo Cas9 y ARNsg interactuar y disociarse de una diana de ADN.
Nuestra primera sorpresa llegó cuando descubrimos que catalíticamente inactivo dCas9 (por sus siglas en inglés) toma una muy mucho tiempo para disociarse del ADN. ¡Como en, seis horas o más! Mucho más de lo que cabría esperar de un enzima eso es básicamente una enzima de restricción retargetable. Nuestra segunda sorpresa llegó cuando descubrimos que Cas9 activo e inactivo se comportan de manera idéntica a este respecto, incluso después de que Cas9 corta un objetivo de ADN, permanece unido durante seis horas. Este período de tiempo fue significativo para nosotros, ya que tenía sentido para un misterio. Cuando uno hace roturas de doble hebra in eucariotas células que utilizan radiación, se reparan muy rápidamente. Pero cuando Cas9 hace el doble hebra se rompe, en lugar de eso, toma (espéralo) unas seis horas para que sean reparadas.
Usando moléculas de ADN etiquetadas, encontramos que Cas9 se aferra globalmente a ambos lados de un dúplex cortado. Es decir, ninguno de los semidúplex se aleja flotando. Pero luego nos preguntamos acerca de la naturaleza más fina del complejo después del corte. Fue entonces cuando recibimos nuestra tercera sorpresa. Resulta que cuando Cas9 se aferra a las cuatro hebras del dúplex escindido (piense en eso por un momento), solo se aferra a tres de ellas. La hebra de ADN opuesta a la PAM en la hebra no objetivo (la que no está unida por el sgRNA) se agita con la brisa. Tan es así que in vitro podríamos recocer un complementario pedazo de ssDNA. dCas9 hace lo mismo, pero como no corta el ADN objetivo, ahora se forma una burbuja de ADN intacta frente al ARNg. Si esa descripción lo deja bizco, aquí hay una imagen de lo que quiero decir (el gris es Cas9, el azul es el sgRNA, el amarillo es el PAM, el rojo son los sitios activos y las x blancas son el lugar donde Cas9 sostiene firmemente el objetivo).
La capacidad de hibridar oligonucleótidos monocatenarios complementarios con un colgajo de ADN nos recuerda a trabajo reciente del laboratorio de Nancy Maizels, que describió un mella estructura de reparación en la que plantillas de reparación de una sola hebra recocidas a un lado de una solapa. Pasando a las células humanas, preguntamos si los donantes de oligonucleótidos capaces de hibridar con el colgajo Cas9 podrían usarse para el reemplazo de secuencias. Y quedamos muy gratamente sorprendidos. El colgajo Cas9 es del orden de 20-30 nucleótidosy, de hecho, descubrimos que la edición de donantes complementarios al colgajo en unos 30 nucleótidos funcionó de manera consistente con el mejor de todos los donantes. Las frecuencias absolutas variaron, pero en un locus observamos reproduciblemente hasta un 60% de reemplazo de secuencia. Hacer que la región complementaria sea más corta disminuyó la eficiencia como era de esperar, y al hacerla más larga también causó una disminución, creemos porque tendría que entrometerse en el dúplex intacto fuera del colgajo.
Finalmente, decidimos probar un experimento loco. Nos preguntamos si la burbuja formada por dCas9 catalíticamente inactivo podría usarse para templar un donante monocatenario en células, y si esa célula podría engañarse para usarla para la reparación. Al apuntar tres dCas9s a una región espaciada con precisión que coincide con la longitud de un donante de una sola hebra y todo en la misma hebra de ADN, observamos tasas de reemplazo de secuencia de un poco menos del 1%. Esto no es de ninguna manera una gran cantidad, pero se logró sin ninguna de las reparaciones propensas a errores que normalmente acompañan al corte Cas9. Todavía no conocemos el mecanismo subyacente a la edición de dCas9, pero podría ser muy útil para abordar enfermedades genéticas en las que el reemplazo de secuencia tiene algún tipo de ventaja de aptitud pero reparación propensa a errores del gen sería desastroso (por ejemplo, si romper el gen es peor que dejar el crianza de organismos con mutación deseada solo).
Tengo mucha curiosidad sobre el mecanismo de flappy inesperado de Cas9 y me pregunto si juega algún papel en el papel de Cas9 en CRISPR anti-virales biología. También estoy cada vez más intrigado por el mecanismo por el cual la célula utiliza donantes monocatenarios. eric hendrickson y nancy maizelas tengo algunas historias geniales en ese frente, y mi laboratorio tiene algunos datos que parecen arrojar algo de luz. En una nota más práctica, Cas9 actualmente es muy bueno para romper genes, pero su capacidad para introducir mutaciones con precisión se ha quedado atrás. Soy optimista de que estos enfoques simples para diseñar un experimento de reemplazo de secuencia que descubrimos, que no se basa en la manipulación química de las células, pueden ser útiles para abordar una variedad de enfermedades genéticas. Más sobre eso pronto.
Este manuscrito fue elaborado por un equipo estelar: el postdoctorado Chris Richardson, el técnico Jordan Ray (muy pronto en camino a la escuela de posgrado), la ex directora de laboratorio Gemma Curie y el postdoctorado Mark DeWitt. ¡Felicidades a ellos!